M ỤC LỤC
1.3.2 Nguồn cơ chất mạt cưa:
Mạt cưa cũng là một phần của phế liệu nông nghiệp tuy nhiên nếu biết cách sử dụng chúng một cách hợp lý thì sẽ mang lại những lợi ích rất lớn.
Đối với ngành trồng nấm thì mạt cưa có thể nói là nguồn cơ chất chính, với thành phần dinh dưỡng như: cellulose, ligin, hemicellulose, và các thành phần khác. Trong đó cellulose chiếm tỉ lệ khá cao (70%), là thành phần rất thích hợp cho sự phát triển của các loài nấm ăn.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài:
2.1.1 Địa điểm:
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - trường Đại học Nha Trang.
2.1.2 Thời gian:
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3 đến tháng 6/2011
2.2 Vật liệu, hoá chất và thiết bị: 2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị: 2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị:
Dụng cụ và trang thiết bị sử dụng tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – trường Đại học Nha Trang, gồm:
- Tủ cấy (hãng Telstar, Tây Ban Nha).
- Nồi hấp Auto clave (hãng Sturdy industrial Đài Loan). - Tủ sấy (hãng Binder, Đức).
- Lò vi sóng (hãng LG, Hàn Quốc).
- Cân điện tử, Ống nghiệm, pipet các loại, bông không thắm, chai thủy tinh, đĩa Petri, bình tam giác, đèn cồn.
- Các loại que cấy, nhíp, thìa, dao dung để phân lập và cấy nấm.
2.2.2 Nguyên vật liệu và hoá chất:
- Mẫu giống nấm: Nguồn mẫu giống nấm để thực hiện các thí nghiệm của đề tài nhận được từ Viện Công nghệ sinh học và Môi trường – Đại học Nha Trang. Mẫu giống nấm phải đạt các tiêu chuẩn sau:
+ Là giống thuần, không lẫn tạp. + Tơ mọc khỏe chia nhánh đều.
+ Tơ mọc sát mặt thạch hoặc ăn vòm thành ống nghiệm, ít tơ rối bông.
- Môi trường PGA cải tiến (môi trường phân lập và nhân giống cấp 1): nước chiết, glucose, cao nấm men, agar. (Nước chiết gồm có: giá đỗ, khoai tây, cà rốt,…)
- Môi trường hạt lúa (môi trường nhân giống cấp 2): thóc, cám gạo, CaCO3. - Môi trường nuôi trồng ra quả thể: vỏ trấu, mạt cưa, cám gạo, vôi bột, vi lượng (KH2PO4, MgSO4,…)
2.3 Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1 Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm, hình thái của tơ nấm bào ngư Nhật trên môi trường thạch (giống cấp 1). môi trường thạch (giống cấp 1).
2.3.1.1 Chuẩn bị môi trường thạch:
Môi trường thạch được chuẩn bị theo bảng 2.1
Bảng 2.1: Thành phần của môi trường PGA cải tiến
Thành phần Hàm lượng
Nước chiết dinh dưỡng (*) Glucose Agar KH2PO4 Peptone MgSO4 1 lít 20 g 20 g 1 g 1 g 1 g
Khoai tây, cà rốt được gọt vỏ rửa rồi cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nước, đun sôi khoảng 20 phút, lọc lấy nước chiết và bổ sung nước cất cho đủ 1 lít. Sau đó bổ sung agar và các thành phần còn lại vào và đun cho chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng 700C (áp vào má có thể chịu được) đem rót vào trong các ống nghiệm, đĩa petri và bình tam giác, dùng để cấy chuyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm. Với ống nghiệm rót 1/3 chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác và đĩa petri thì đổ dày khoảng 1cm. Không đổ môi trường vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi nước sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ướt bề mặt thạch. Cũng không đỗ môi trường khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trường đã bị đông vón lại. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong 30 phút. Sau khi khử trùng xong, các ống nghiệm được xếp nghiêng. Môi trường giữ qua 24 giờ, để xem có nhiễm không rồi mới sử dụng.
2.3.1.2 Các bước tiến hành:
Việc khảo sát tốc độ lan tơ nấm và mô tả hình thái đối tượng nghiên cứu trên môi trường thạch được tiến hành như sau:
- Dùng que cấy, dao mổ và pince tách lấy phần thạch có tơ nấm, rồi cắt thành từng miếng độ 6mm2, dùng pince cấy đưa vào ống nghiệm dựng thạch nghiêng. Đặt miếng mô thật êm trên mặt thạch nghiêng.
- Toàn bộ công việc trên được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Sau đó các ống giống cấp một sẽ được ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 27 – 320C, quá trình ủ tiến hành trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ 500 -1000 lux. Theo dõi sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Nếu mẫu cấy bị nhiễm bệnh thì xung quanh mẫu sẽ thấy có khuẩn lạc nấm mốc lạ và tơ nấm sẽ phát triển rất chậm. Còn mẫu cấy đạt chất lượng sẽ có tơ nấm có màu trắng phát triển nhanh và không có biểu hiện nhiễm bệnh.
Tiến hành quan sát và ghi nhận kết quả kể từ khi sợi nấm bắt đầu bám vào bề mặt môi trường, định kỳ 3 ngày 1 lần.
Hình 2.2: cấy chuyền giống chuẩn sang các ống thạch nghiên khác. [1, tr.157]
2.3.1.3 Các biện pháp để giống không bị tạp:
Kỹ thuật vô trùng:
- Vô trùng môi trường dinh dưỡng: phương pháp phổ biến hiện nay là dùng hơi nước nóng có áp suất (121oC, 30phút).
- Vô trùng dụng cụ: vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, sấy ở nhiệt độ 160oC trong thời gian 120 phút đối với các dụng cụ nuôi cấy. Có thể sử dụng tia tử ngoại vô trùng buồng cấy hoặc dung dịch hoá chất như dung dịch formaldehyde.
- Vô trùng nơi làm việc: phòng cấy phải kín gió, không có những nguồn bệnh, vệ sinh.
- Vô trùng trong thao tác: làm gọn, khéo, tránh thở mạnh, nói chuyện trong khi làm việc.
2.3.2 Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm của tơ nấm và hình thái của nấm bào ngư Nhật trên môi trường hạt (giống cấp 2). Nhật trên môi trường hạt (giống cấp 2).
2.3.2.1 Chuẩn bị môi trường hạt:
Môi trường hạt lúa có bổ sung cám gạo cũng là môi trường được chọn để nhân giống cấp hai đối với nấm bào ngư Nhật.
Công thức môi trường hạt:
Quá trình chuẩn bị môi trường hạt được tiến hành như sau: - Lúa ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch. - Cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung ra thì dừng lại.
- Cho hạt thóc đã nở bung vào chai thuỷ tinh rồi bổ sung thêm 10% cám gạo, 1% CaCO3.
- Khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 60 phút, hấp xong để nguội.
2.3.2.2 Các bước tiến hành:
Để khảo sát tốc độ lan tơ, chúng tôi tiến hành như sau:
- Cấy các giống cấp một (trong môi trường thạch) vào trong chai có môi trường hạt.
- Tiến hành theo dõi sự phát triển của mẫu trong 3 ngày đầu. Loại bỏ các cấy có xuất hiện khuẩn lạc của nấm mốc. Thu nhận các mẫu cấy có tơ nấm màu trắng phát triển bình thường để làm giống cấp hai.
- Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng.
- Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám trên môi trường đến khi ăn trắng chai, với thời gian định kỳ là 3 ngày.
- Nhận xét đặc điểm phát triển. - Xử lý số liệu và vẽ biểu đồ mô tả.
2.3.3 Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm trên cơ chất tổng hợp:
2.3.3.1 Chuẩn bị môi trường cơ chất tổng hợp:
Sau khi đã nhân giống cấp một, cấp hai thành công đối tượng trên với số lượng khá nhiều. Tiếp theo sẽ cấy giống cấp hai vào môi trường cơ tổng hợp để tiến hành nuôi trồng khảo nghiệm.
Công thức giá thể tổng hợp:
Bảng 2.2: Thành phần môi trường cơ chất tổng hợp.
Thành phần Tỷ lệ (%)
Cám gạo Vôi Đường
Supper lân (Ca(H2PO4)2)
Sulphatamon ((NH4)2SO4) Vỏ trấu Mùn cưa Nước 5 2 1,5 1 0.5 0-45-60-90 90-45-30-0 Vừa đủ ẩm
Quá trình chuẩn bị giá thể như sau:
- Vỏ trấu được thu mua tại các nhà máy xay xát, ngâm vôi 0,5% trong 36 giờ, rửa rồi để ráo.
- Mạt cưa: được thu mua từ các xưởng về, được loại bỏ dăm và mảnh vụn. Sau đó, đảo trộn mạt cưa với lân (1%), sulphatamon (0,5%) và nước vôi (1%) và rồi ủ đống. Sau 10 ngày ta tiến hành đảo trộn lại đống ủ.
- Phối trộn 2 cơ chất này lại, rồi bổ sung dinh dưỡng và tiến hành đảo trộn đủ ẩm (khi nắm cơ chất trong tay thấy có nước vừa đủ ứa ra ở kẻ ngón tay là vừa).
- Cho cơ chất vào các bịch PE khoảng 1,0- 1,2 kg. Một bịch kích thước là 18x30 cm. Bịch nén xong tiến hành làm cổ.
- Cơ chất sau khi đóng bịch sẽ được khử trùng ngay. Khử trùng bịch cơ chất ở 121oC, trong vòng 2 giờ.
2.3.3.2 Các bước tiến hành:
Qúa trình khảo sát được tiến hành:
Để nguội 24 giờ, rồi cấy giống cấp hai vào bịch.
Sau đó tiến hành chuyển bịch phôi vào trong trại ủ tơ nấm trong điều kiện ánh sáng khuếch tán nhẹ ở nhiệt độ 27 - 320C, tiến hành quan sát, đánh giá tốc độ phát triển hệ sợi trên cơ chất với tỷ lệ % vỏ trấu khác nhau (0%, 45%, 60%, 90%). và nhận xét về quá trình phát triển của tơ nấm của đối tượng trên.
Yêu cầu đối với nơi ủ tơ:
- Sạch và thoáng mát. Định kỳ được làm vệ sinh bằng formol, nước vôi trong. - Ít ánh sáng nhưng không tối.
- Không bị dột mưa hoặc nắng chiếu.
- Không để chung với đồ đạc sinh hoạt gia đình, vật liệu, sách vở. - Không ủ chung với giàn nấm đang tưới hoặc mới thu hoạch xong.
- Bịch ủ có thể xếp trên kệ. Không chồng chất lên nhau quá nhiều lớp. Không xếp vào ngăn quá kín làm tơ bị ngộp.
Cứ 5 – 7 ngày tiến hành kiểm tra một lần nhằm phát hiện những bịch nhiễm mốc xanh để hủy bỏ, không để lây nhiễm sang các bịch khác.
Trong thời gian nuôi ủ tơi nấm, không cần tưới thường xuyên mà chỉ ở nền, xung quanh vách sao cho đảm bảo nhiệt độ và độ ẩm.
Thời gian nuôi ủ tơ nấm bào ngư Nhật khoảng 30 – 40 ngày.
Sau khi ủ tơ lan trắng đáy bịch, bịch phôi sẽ được chuyễn vào nhà tưới. Bịch sẽ được rút nút, hoặc rạch bịch, mỗi ngày tưới 2- 4 lần để duy trì nhiệt độ thích hợp: 27- 320C. Độ ẩm không khí cần trong khoảng 80 – 85%. Sau 7-10 ngày thì bắt đầu ra quả thể, xuất hiện ở dạng dùi trống rồi chuyển sang dạng lục bình thì ta thu hái.
Khi hái nấm nên hái hết cả cụm, không để sót phần chân nấm vì nó dễ gây nhiễm, làm giảm chất lương, năng suất cho các lần thu hái tiếp theo. Mỗi bịch ta có thể thu hoạch từ 4-5 đợt, kết thúc mỗi đợt nuôi trồng trong khoảng 2,5 - 3 tháng.
Quan sát đánh giá khả năng ra quả thể, so sánh với mẫu đối chứng, thu hái quả thể, xác định trọng lượng tươi của quả thể. Kết luận về việc xây dựng thành quy trình có thể phổ biến.
Hình 2.4: Cách mở miệng bịch phôi đón nấm. [7, tr 127]
2.3.3.3 Quy trình trồng truyền thống trên cơ chất mạt cưa (mẫu đối chứng):
Tương tự như trên, nhưng thành phần môi trường cơ chất được phối trộn theo (bảng2.3).
Bảng 2.3: Thành phần môi trường cơ chất mạt cưa
Thành phần Tỷ lệ (%)
Cám gạo Vôi Đường
Supper lân (Ca(H2PO4)2)
Sulphatamon ((NH4)2SO4) Mạt cưa Nước 5 2 1,5 1 0.5 90 Vừa đủ ẩm
2.3.3.4 Các hiện tượng nhiễm có thể xảy ra, nguyên nhân và hướng khắc phục:
Bảng 2.4:Nguyên nhân và biện pháp khắc phục nhiễm tạp. [7, tr. 61]
Hiện tượng
nhiễm Nguyên nhân Hướng khắc phục
Nhiễm hàng loạt
-Khử trùng không đạt -Giống gốc bị nhiễm
-Xem lại thời gian và nhiệt độ khử trùng -Xem lại việc xử lý nguyên liệu: kích thước, độ ẩm.
-Xem kỹ giống gốc trước khi cấy.
Nhiễm với tỷ lệ cao -Phòng cấy không an toàn -Nút bông bị ướt -Thao tác chưa tốt -Giống gốc bị nhiễm một phần
-Xem lại vệ sinh và che chắn gió. -Nên sử dụng giấy bịt đầu.
-Khi mở nồi hấp, nên chờ 10-15 phút, cho hơi nóng sấy khô nút.
-Ống nghiệm hoặc túi cơ chất sau khi lấy ra khỏi nồi hấp không nên chồng chất lên nhau, để nút bông mau khô.
-Xem lại cách cấy: không thở mạnh, không nói chuyện khi mở nút bông (ống nghiệm hoặc túi cơ chất).
-Kiếm tra kỹ giống trước khi cấy.
Có nhiễm (tỷ lệ không
cao)
-Phòng cấy không kín gió. -Thao tác cấy chưa tốt. -Nút bông bị ướt (nhưng không đồng loạt).
-Nơi ủ không vệ sinh.
-Xem lại việc che chắn. -Cẩn thận trong lúc cấy.
-Làm như cách hướng dẫn ở trên. -Xem lại nơi ủ giống.
2.4 Tính hiệu suất sinh học của nấm bào ngư Nhật trồng trên cơ chất tổng hợp:
Hiệu suất sinh học của nấm bào ngư Nhật trên giá thể là tỷ lệ giữa lượng quả thể thu hoạch/ lượng cơ chất khô.
Khi nấm ra và đạt kích thước tối đa, bắt đầu có biểu hiện già ta tiến hành thu hái và cân đo.
2.5 Phương pháp thu nhận kết quả:
Tốc độ lan tơ nấm được đo 3 lần bằng thước, đơn vị mm. Lấy giá trị trung bình.
Quan sát hình thái bên ngoài và mô tả.
2.6 Phương pháp xử lý số liệu:
- Tất cả số liệu thực nghiệm được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình. Số liệu được xử lý bằng bảng tính Excel. Trung bình mẫu: X = n x n i i 1 Trong đó: X : trung bình mẫu n: tổng số mẫu xi: mẫu đo được
Độ lệch chuẩn mẫu (Standard Deviation):
SD = S = 1 ) ( 1 2 n X X n i i
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả nhân giống và nuôi trồng:
3.1.1 Tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm trên môi trường thạch:
Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm bào ngư Nhật dòng thuần được nuôi cấy trên môi trường thuần khiết PGA ở điều kiện nhiệt độ phòng 26 – 300C, trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ 500 -1000 lux. Kết quả khảo sát dẫn ra ở (bảng 3.1).
Bảng 3.1: Tốc độ lan tơ của nấm bào ngư Nhật trên môi trường thạch:
Thời gian
(ngày)
Chiều dài sợi nấm
(mm) Tốc độ tăng trưởng (mm/ngày) 7 17.33 ±1.312 10 31.83 ± 2.325 13 50.16 ± 2.935 16 73.66 ± 1.125 19 98.83 ±1.450 22 110.5 ± 3.024 5.022
Đồ thị 3.1 Tốc độ lan tơ của nấm bào ngư Nhật trên môi trường thạch PGA (mm/ngày) 0 20 40 60 80 100 120 7 10 13 16 19 22
Thời gian (ngày)
C h iề u d à i s ợ i n ấ m ( m m ) Tốc độ lan tơ
Từ bảng 3.1 tính được tốc độ lan tơ trung bình của tơ nấm trên môi trường thạch.
- Trong 3 ngày (từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10): 4.83 mm/ngày. - Trong 3 ngày (từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 13): 6.11 mm/ngày. - Trong 3 ngày (từ ngày thứ 13 đến ngày thứ 16): 7.83 mm/ngày. - Trong 3 ngày (từ ngày thứ 16 đến ngày thứ 19): 8.39 mm/ngày. - Trong 2 ngày (từ ngày thứ 19 đến ngày thứ 22): 3.89 mm/ngày.
Nhận xét:
Sau 3 ngày đầu kể từ khi cấy giống, mẫu cấy chưa bung sợi do chúng vừa bị tổn thương và chưa thích ứng ngay được với môi trường mới. Đến ngày thứ 4 – 5 các mẫu cấy đồng loạt bung tơ. Tuy nhiên các sợi nấm chưa bám vào bề mặt của môi trường, sau ngày thứ 5 đến hết ngày thứ 6, sợi nấm tiếp tục phát triển và ăn sâu xuống bề mặt của môi trường, tới ngày thứ 7 sợi nấm đã lan được 17.33 mm. Về hình thái, sợi nấm rất mảnh và thưa, màu trắng nhạt, có hiện tượng có các sợi nấm vươn dài ra phía trước, phân nhánh.
Đến ngày 10 sợi nấm lan được khoảng 31.83 mm. Tốc độ lan tơ trung bình của tơ nấm trong từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10 là 4.83 mm/ngày. Khi đến ngày 13 chiều dài của sợi nấm là 50.16 mm. Chỉ trong 3 ngày (từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 13) tốc độ lan trung bình của tơ nấm đã tăng rất nhanh là 6.11 mm/ngày.
Tổ chức của sợi nấm chặt chẽ hơn khi sợi nấm đạt độ tuổi 16 ngày, bề mặt thạch có màu trắng ngà, ít có sự phân hóa tổ chức sợi nấm như trước, tơ nấm vươn