Giới thiệu về nguồn cơ chất trồng nấm:

M ỤC LỤC

1.3. Giới thiệu về nguồn cơ chất trồng nấm:

1.3.1 Nguồn cơ chất vỏ trấu:

Ngành nông nghiệp trồng lúa thế giới trong những năm gần đây đã đạt được những tiến bộ vượt bậc trong việc áp dụng công nghệ sinh học nhằm nâng cao năng suất góp phần tạo ra tổng sản lượng lúa toàn cầu ước tính 640 triệu tấn năm 2007. Ở Việt Nam, thành tựu này còn nổi bật hơn với tổng sản lượng lúa hàng năm đạt 36 triệu tấn và dự kiến đến năm 2020 con số này sẽ tăng lên 40 triệu tấn năm

Khi chế biến, cứ mỗi tấn lúa tạo ra khoảng 200 kg vỏ trấu và lượng vỏ trấu này sau khi đốt tạo ra khoảng 40 kg tro. Như vậy, trung bình hàng năm thế giới tạo ra khảng 130 triệu tấn vỏ trấu. Hiện tại, hầu hết lượng vỏ trấu tạo ra chưa được tận dụng mà bị vứt bỏ như là một dạng chất thải nông nghiệp. Chất thải này tập trung phổ biến ở các quốc gia nông nghiệp. Riêng Việt Nam, khối lượng chất thải vỏ trấu trung bình là 8 triệu tấn năm. Do chưa có giải pháp xử lý hiệu quả nên vỏ trấu sau khi bị thải thẳng ra môi trường đã gây hậu quả nghiệm trọng về ô nhiễm môi trường, nhất là nguồn nước và các nguồn lợi gắn liền với nguồn nước.

Hình 1.9: Vỏ trấu. [23]

Tuy nhiên vỏ trấu có chứa hàm lượng dinh dưỡng khá phù hợp với việc phát triển của nấm ăn.

Thành phần của vỏ trấu:

Vỏ trấu có kích thước trung bình khoảng 8 - 10 mm dài, 2 - 3 mm rộng và 0.2 mm dày. Khối lượng thể tích của vỏ trấu khi nén trong bao đựng khoảng 122 kg/m3. Thành phần hoá học của vỏ trấu thay đổi theo loại thóc, mùa vụ canh tác, điều kiện khí hậu và đặc trưng vùng miền. Tuy nhiên, hầu hết các loại vỏ trấu có thành phần hữu cơ chiếm trên 90% theo khối lượng. Các hợp chất chính có cấu trúc xốp dạng cellulose và ligin. ( Bảng 1.9)

Bảng 1.9: Thành phần hữu cơ của vỏ trấu. [23]

Thành phần chủ yếu Tỷ lệ theo khối lượng (%)

∝-cellulose Lignin D-xylose I-arabinose Methylglucuronic axít D-galactose 43.30 22.00 17.52 6.53 3.27 2.37 Tổng cộng 94.99  Cellulose:

Cellulose là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm 50% tổng lượng hydrocacbon trên trái đất. Ngoài thực vật là nguồn chủ yếu còn ở trong giới động vật, nhưng số lượng rất ít.

Cellulose là polysaccarit liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucozit, mức độ polymer hóa của cellulose rất cao tới 10.000 – 14.000 đơn vị glucoza/phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và ngoại phân tử làm cho phân tử cellulose có độ cứng và vững chắc.

Hình 1.10: Cấu trúc phân tử cellulose.[9]

Liên kết glucozit không bền với acid. Cellulose dễ bị phân hủy bởi acid và tạo thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro-cellulose có độ bền cơ học kém hơn cellulose nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo thành là D-glucoza.

Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo thành cellulose-ancolat. Nguyên tử hydro ở các nhóm –OH bậc một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc –metyl, - etyl,... tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác nhau.

Cellulose cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy – cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4), và muối của nó. Cellulose không tan trong nước, dung dịch kiềm làm trương phồng mạch cellulose và hòa tan một phần cellulose phân tử nhỏ. Đặc biệt cellulose dễ hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat [Cu(NH3)4(OH)2], và hàng loạt các dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadmi, kẽm,...(J.F.Kennedy, 1989).

 Lignin

Lignin là một polymer gốc rượu, có cấu trúc 3 chiều rất phức tạp và có nhiệm vụ nâng đỡ cấu trúc tế bào gỗ. Sau cellulose, lignin là một polymer phong phú trong tự nhiên được thực vật tổng hợp và là phần lớn nguồn chất thơm đa dạng trên trái đất. Sự có mặt của lignin giúp cho tế bào thực vật cứng rắn hơn và đồng thời giúp

cho thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Lignin được tìm thấy trong vách tế bào ở dạng phức hợp với những polysaccharide như cellulose và hemicelluloses, nó cũng giúp bảo vệ những polysaccharide này khỏi sự phân hủy sinh học.

Lignin được sinh tổng hợp bởi sự polymer hóa các tiền chất phenylpropanoid. Có 3 loại tiền chất được phân loại tùy thuộc theo số lượng nhóm methoxyl trên vòng thơm.

Lignin gỗ mềm chức hầu hết những đơn vị guaiacyl (1 nhóm methoxy), lignin gỗ cứng chứa số lượng cân bằng guaiacyl và suringyl (2 nhóm methoxy), các lignin khác chứa cả p-hidroxyphenyl (không có nhóm methoxy), và cả 2 loại kia [9].

Hình 1.11: Cấu trúc phân tử lignin. [9]

1.3.2 Nguồn cơ chất mạt cưa:

Mạt cưa cũng là một phần của phế liệu nông nghiệp tuy nhiên nếu biết cách sử dụng chúng một cách hợp lý thì sẽ mang lại những lợi ích rất lớn.

Đối với ngành trồng nấm thì mạt cưa có thể nói là nguồn cơ chất chính, với thành phần dinh dưỡng như: cellulose, ligin, hemicellulose, và các thành phần khác. Trong đó cellulose chiếm tỉ lệ khá cao (70%), là thành phần rất thích hợp cho sự phát triển của các loài nấm ăn.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài:

2.1.1 Địa điểm:

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - trường Đại học Nha Trang.

2.1.2 Thời gian:

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3 đến tháng 6/2011

2.2 Vật liệu, hoá chất và thiết bị: 2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị: 2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị:

Dụng cụ và trang thiết bị sử dụng tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – trường Đại học Nha Trang, gồm:

- Tủ cấy (hãng Telstar, Tây Ban Nha).

- Nồi hấp Auto clave (hãng Sturdy industrial Đài Loan). - Tủ sấy (hãng Binder, Đức).

- Lò vi sóng (hãng LG, Hàn Quốc).

- Cân điện tử, Ống nghiệm, pipet các loại, bông không thắm, chai thủy tinh, đĩa Petri, bình tam giác, đèn cồn.

- Các loại que cấy, nhíp, thìa, dao dung để phân lập và cấy nấm.

2.2.2 Nguyên vật liệu và hoá chất:

- Mẫu giống nấm: Nguồn mẫu giống nấm để thực hiện các thí nghiệm của đề tài nhận được từ Viện Công nghệ sinh học và Môi trường – Đại học Nha Trang. Mẫu giống nấm phải đạt các tiêu chuẩn sau:

+ Là giống thuần, không lẫn tạp. + Tơ mọc khỏe chia nhánh đều.

+ Tơ mọc sát mặt thạch hoặc ăn vòm thành ống nghiệm, ít tơ rối bông.

- Môi trường PGA cải tiến (môi trường phân lập và nhân giống cấp 1): nước chiết, glucose, cao nấm men, agar. (Nước chiết gồm có: giá đỗ, khoai tây, cà rốt,…)

- Môi trường hạt lúa (môi trường nhân giống cấp 2): thóc, cám gạo, CaCO3. - Môi trường nuôi trồng ra quả thể: vỏ trấu, mạt cưa, cám gạo, vôi bột, vi lượng (KH2PO4, MgSO4,…)

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm, hình thái của tơ nấm bào ngư Nhật trên môi trường thạch (giống cấp 1). môi trường thạch (giống cấp 1).

2.3.1.1 Chuẩn bị môi trường thạch:

Môi trường thạch được chuẩn bị theo bảng 2.1

Bảng 2.1: Thành phần của môi trường PGA cải tiến

Thành phần Hàm lượng

Nước chiết dinh dưỡng (*) Glucose Agar KH2PO4 Peptone MgSO4 1 lít 20 g 20 g 1 g 1 g 1 g

Khoai tây, cà rốt được gọt vỏ rửa rồi cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nước, đun sôi khoảng 20 phút, lọc lấy nước chiết và bổ sung nước cất cho đủ 1 lít. Sau đó bổ sung agar và các thành phần còn lại vào và đun cho chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng 700C (áp vào má có thể chịu được) đem rót vào trong các ống nghiệm, đĩa petri và bình tam giác, dùng để cấy chuyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm. Với ống nghiệm rót 1/3 chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác và đĩa petri thì đổ dày khoảng 1cm. Không đổ môi trường vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi nước sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ướt bề mặt thạch. Cũng không đỗ môi trường khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trường đã bị đông vón lại. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong 30 phút. Sau khi khử trùng xong, các ống nghiệm được xếp nghiêng. Môi trường giữ qua 24 giờ, để xem có nhiễm không rồi mới sử dụng.

2.3.1.2 Các bước tiến hành:

Việc khảo sát tốc độ lan tơ nấm và mô tả hình thái đối tượng nghiên cứu trên môi trường thạch được tiến hành như sau:

- Dùng que cấy, dao mổ và pince tách lấy phần thạch có tơ nấm, rồi cắt thành từng miếng độ 6mm2, dùng pince cấy đưa vào ống nghiệm dựng thạch nghiêng. Đặt miếng mô thật êm trên mặt thạch nghiêng.

- Toàn bộ công việc trên được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Sau đó các ống giống cấp một sẽ được ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 27 – 320C, quá trình ủ tiến hành trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ 500 -1000 lux. Theo dõi sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Nếu mẫu cấy bị nhiễm bệnh thì xung quanh mẫu sẽ thấy có khuẩn lạc nấm mốc lạ và tơ nấm sẽ phát triển rất chậm. Còn mẫu cấy đạt chất lượng sẽ có tơ nấm có màu trắng phát triển nhanh và không có biểu hiện nhiễm bệnh.

Tiến hành quan sát và ghi nhận kết quả kể từ khi sợi nấm bắt đầu bám vào bề mặt môi trường, định kỳ 3 ngày 1 lần.

Hình 2.2: cấy chuyền giống chuẩn sang các ống thạch nghiên khác. [1, tr.157]

2.3.1.3 Các biện pháp để giống không bị tạp:

Kỹ thuật vô trùng:

- Vô trùng môi trường dinh dưỡng: phương pháp phổ biến hiện nay là dùng hơi nước nóng có áp suất (121oC, 30phút).

- Vô trùng dụng cụ: vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, sấy ở nhiệt độ 160oC trong thời gian 120 phút đối với các dụng cụ nuôi cấy. Có thể sử dụng tia tử ngoại vô trùng buồng cấy hoặc dung dịch hoá chất như dung dịch formaldehyde.

- Vô trùng nơi làm việc: phòng cấy phải kín gió, không có những nguồn bệnh, vệ sinh.

- Vô trùng trong thao tác: làm gọn, khéo, tránh thở mạnh, nói chuyện trong khi làm việc.

2.3.2 Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm của tơ nấm và hình thái của nấm bào ngư Nhật trên môi trường hạt (giống cấp 2). Nhật trên môi trường hạt (giống cấp 2).

2.3.2.1 Chuẩn bị môi trường hạt:

Môi trường hạt lúa có bổ sung cám gạo cũng là môi trường được chọn để nhân giống cấp hai đối với nấm bào ngư Nhật.

Công thức môi trường hạt:

Quá trình chuẩn bị môi trường hạt được tiến hành như sau: - Lúa ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch. - Cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung ra thì dừng lại.

- Cho hạt thóc đã nở bung vào chai thuỷ tinh rồi bổ sung thêm 10% cám gạo, 1% CaCO3.

- Khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 60 phút, hấp xong để nguội.

2.3.2.2 Các bước tiến hành:

Để khảo sát tốc độ lan tơ, chúng tôi tiến hành như sau:

- Cấy các giống cấp một (trong môi trường thạch) vào trong chai có môi trường hạt.

- Tiến hành theo dõi sự phát triển của mẫu trong 3 ngày đầu. Loại bỏ các cấy có xuất hiện khuẩn lạc của nấm mốc. Thu nhận các mẫu cấy có tơ nấm màu trắng phát triển bình thường để làm giống cấp hai.

- Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng.

- Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám trên môi trường đến khi ăn trắng chai, với thời gian định kỳ là 3 ngày.

- Nhận xét đặc điểm phát triển. - Xử lý số liệu và vẽ biểu đồ mô tả.

2.3.3 Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm trên cơ chất tổng hợp:

2.3.3.1 Chuẩn bị môi trường cơ chất tổng hợp:

Sau khi đã nhân giống cấp một, cấp hai thành công đối tượng trên với số lượng khá nhiều. Tiếp theo sẽ cấy giống cấp hai vào môi trường cơ tổng hợp để tiến hành nuôi trồng khảo nghiệm.

Công thức giá thể tổng hợp:

Bảng 2.2: Thành phần môi trường cơ chất tổng hợp.

Thành phần Tỷ lệ (%)

Cám gạo Vôi Đường

Supper lân (Ca(H2PO4)2)

Sulphatamon ((NH4)2SO4) Vỏ trấu Mùn cưa Nước 5 2 1,5 1 0.5 0-45-60-90 90-45-30-0 Vừa đủ ẩm

Quá trình chuẩn bị giá thể như sau:

- Vỏ trấu được thu mua tại các nhà máy xay xát, ngâm vôi 0,5% trong 36 giờ, rửa rồi để ráo.

- Mạt cưa: được thu mua từ các xưởng về, được loại bỏ dăm và mảnh vụn. Sau đó, đảo trộn mạt cưa với lân (1%), sulphatamon (0,5%) và nước vôi (1%) và rồi ủ đống. Sau 10 ngày ta tiến hành đảo trộn lại đống ủ.

- Phối trộn 2 cơ chất này lại, rồi bổ sung dinh dưỡng và tiến hành đảo trộn đủ ẩm (khi nắm cơ chất trong tay thấy có nước vừa đủ ứa ra ở kẻ ngón tay là vừa).

- Cho cơ chất vào các bịch PE khoảng 1,0- 1,2 kg. Một bịch kích thước là 18x30 cm. Bịch nén xong tiến hành làm cổ.

- Cơ chất sau khi đóng bịch sẽ được khử trùng ngay. Khử trùng bịch cơ chất ở 121oC, trong vòng 2 giờ.

2.3.3.2 Các bước tiến hành:

Qúa trình khảo sát được tiến hành:

Để nguội 24 giờ, rồi cấy giống cấp hai vào bịch.

Sau đó tiến hành chuyển bịch phôi vào trong trại ủ tơ nấm trong điều kiện ánh sáng khuếch tán nhẹ ở nhiệt độ 27 - 320C, tiến hành quan sát, đánh giá tốc độ phát triển hệ sợi trên cơ chất với tỷ lệ % vỏ trấu khác nhau (0%, 45%, 60%, 90%). và nhận xét về quá trình phát triển của tơ nấm của đối tượng trên.

Yêu cầu đối với nơi ủ tơ:

- Sạch và thoáng mát. Định kỳ được làm vệ sinh bằng formol, nước vôi trong. - Ít ánh sáng nhưng không tối.

- Không bị dột mưa hoặc nắng chiếu.

- Không để chung với đồ đạc sinh hoạt gia đình, vật liệu, sách vở. - Không ủ chung với giàn nấm đang tưới hoặc mới thu hoạch xong.

- Bịch ủ có thể xếp trên kệ. Không chồng chất lên nhau quá nhiều lớp. Không xếp vào ngăn quá kín làm tơ bị ngộp.

Cứ 5 – 7 ngày tiến hành kiểm tra một lần nhằm phát hiện những bịch nhiễm mốc xanh để hủy bỏ, không để lây nhiễm sang các bịch khác.

Trong thời gian nuôi ủ tơi nấm, không cần tưới thường xuyên mà chỉ ở nền, xung quanh vách sao cho đảm bảo nhiệt độ và độ ẩm.

Thời gian nuôi ủ tơ nấm bào ngư Nhật khoảng 30 – 40 ngày.

Sau khi ủ tơ lan trắng đáy bịch, bịch phôi sẽ được chuyễn vào nhà tưới. Bịch sẽ được rút nút, hoặc rạch bịch, mỗi ngày tưới 2- 4 lần để duy trì nhiệt độ thích hợp: 27- 320C. Độ ẩm không khí cần trong khoảng 80 – 85%. Sau 7-10 ngày thì bắt đầu ra quả thể, xuất hiện ở dạng dùi trống rồi chuyển sang dạng lục bình thì ta thu hái.

Khi hái nấm nên hái hết cả cụm, không để sót phần chân nấm vì nó dễ gây nhiễm, làm giảm chất lương, năng suất cho các lần thu hái tiếp theo. Mỗi bịch ta có thể thu hoạch từ 4-5 đợt, kết thúc mỗi đợt nuôi trồng trong khoảng 2,5 - 3 tháng.

Quan sát đánh giá khả năng ra quả thể, so sánh với mẫu đối chứng, thu hái quả thể, xác định trọng lượng tươi của quả thể. Kết luận về việc xây dựng thành quy trình có thể phổ biến.

Hình 2.4: Cách mở miệng bịch phôi đón nấm. [7, tr 127]

2.3.3.3 Quy trình trồng truyền thống trên cơ chất mạt cưa (mẫu đối chứng):

Tương tự như trên, nhưng thành phần môi trường cơ chất được phối trộn theo (bảng2.3).

Bảng 2.3: Thành phần môi trường cơ chất mạt cưa

Thành phần Tỷ lệ (%)

Cám gạo Vôi Đường

Supper lân (Ca(H2PO4)2)

Sulphatamon ((NH4)2SO4) Mạt cưa Nước 5