Thế hệ M2 ựược phát triển từ M1 gồm ba giống ựược xử lý ựột biến từ ba giống gốc là đT12, đT20 và đVN6 với liều lượng là 21 Kr.
Ở các quần thể mỗi giống ựược xử lý ựột biến, thu hoạch ngẫu nhiên 50 cá thể/quần thể. Mỗi cá thể M1 từ các quần thể ựược thu hoạch riêng, hạt của mỗi cá thể ựược gieo trồng thành hàng ở thế hệ M2. Do ựó tổng số gia ựình nghiên cứu, ựánh giá ở thế hệ M2 là 150 dòng.
Xác ựịnh và chọn lọc các dạng ựột biến từ các gia ựình
3.3.2. Thế hệ M3
đánh giá ựặc ựiểm nông học của các dòng ựậu tương ựột biến.
Tiến hành ựánh giá và chọn lọc các dạng ựột biến ở thế hệ M2, tiến hành thu hoạch riêng, gieo trồng thành từng dòng ở thế hệ M3 và so sánh với ựối chứng.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 41
3.3.3. Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược tiến hành trên ựồng ruộng. Bố trắ thắ nghiệm không lặp lại, sử dụng ựối chứng là ba giống gốc (cứ 10 dòng lại trồng một ựối chứng).
Các chỉ tiêu theo dõi ở thế hệ M2 và M3 (các tắnh trạng ựược theo dõi bắt ựầu từ khi cây ựậu tương mọc tuỳ theo từng tắnh trạng và theo dõi trên từng cá thể). Các tắnh trạng theo dõi ựể ựánh giá ựược dựa trên phiếu mô tả và ựánh giá nguồn gen ựậu tương của Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam, bao gồm:
Tắnh trạng chất lượng
Kiểu sinh trưởng 1- Hữu hạn 2- Vô hạn 3- Bán hữu hạn Màu thân hạ diệp 1- Xanh 2- Tắm
Hình dạng lá chét 3- Hẹp 5- Trung gian 7- Rộng Màu sắc lá 1- Xanh 2- Xanh nhạt 3- Xanh ựậm Màu sắc hoa 3- Trắng 5- Tắm ựậm 7- Tắm
Màu sắc quả 3- Nâu nhạt 5- Nâu 7- đen Màu vỏ hạt 1- Vàng sáng 2- Vàng 3-Xanh Kiểu rốn hạt 1- Rốn nông 2- Rốn sâu
Màu rốn hạt 1- Trắng 2- Vàng 3- Nâu nhạt 4- Nâu 5-Nâu ựậm 6-đen độ bóng của hạt 3- Bóng 5- Trung bình 7- đục
Hình dạng hạt 1-Elip 2- Trứng 3- Tròn dẹt 4- Tròn 5- Hình thận
Tắnh trạng số lượng
- Thời gian sinh trưởng
+ Thời gian từ khi gieo ựến khi cây ra hoa (ngày). + Thời gian từ khi gieo ựến khi ựậu quả (ngày). + Thời gian từ khi gieo ựến khi thu hoạch (ngày). - Số lá chét 3 lá 4 - 6 lá
- Số cành cấp 1/cây (cành). - độ dài cành cấp1 (cm).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 42 - Số ựốt/thân chắnh (ựốt).
- Chiều cao ựóng quả (cm). - Chiều cao cây cuối cùng (cm).
- Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất: Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất ựược xác ựịnh khi thu hoạch, bao gồm:
+ Số quả trên cây (quả/ cây): tổng số quả trên cây khi thu hoạch ựược ựếm trên từng cá thể. Tổng số quả ựược phân chia thành quả chắc, số quả 1 hạt, 2 hạt, 3 hạt và tắnh tỉ lệ phần trăm từng loại:
* Tỷ lệ quả chắc (%) = x 100
* Tỷ lệ quả 1, 2 hay 3 hạt (%) = x 100
+ Khối lượng 1000 hạt (g) + Năng suất cá thể.
Mật ựộ duy trì sau khi gieo là 30 cây/m2.
3.3.4. Phân tắch chỉ thị SSR
3.3.4.1 Quy trình tách chiết DNA
Các mẫu lá non trên cây ở các dòng có kiểu hình khác với giống gốc ựược chọn sao cho các mẫu không bị các bệnh do các nấm, virus hay các bệnh khác có thể gây ảnh hưởng ựến chất lượng của DNA mẫu cần phân tắch sau này.
Quy trình tách chiết DNA tổng số ựược tiến hành theo các bước sau: Bước 1: mỗi dòng lấy 5 lá non ở 5 cây khác nhau giai ựoạn 2 Ờ 3 lá thật, lá non sau khi thu còn tươi ựược giữ trong tủ lạnh sâu -200C trước khi nghiền mẫu
Bước 2: cắt khoảng 2cm mẫu lá cho vào cối, nhỏ 400ộl dung dịch chiết tách DNA (Tris-HCl+SDS+H2O) vào cối sứ rồi lấy chày nghiền mẫu lá cho ựến khi dịch chiết chuyển sang màu xanh (dạng dịch ựồng thể). Sau ựó chuyển sang ống eppendorp 1,5ml ựược ựánh dấu tên dòng..
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 43 Bước 3: ủ mẫu ở 650C trong 15 phút, trong 15 phút tiến hành ựảo 2 lần. Bước 4: bổ sung 200 ộl 5MK-acetate, lắc nhẹ rồi ựể trên ựá trong 30 phút. Sau ựó ly tâm 12000 vòng/phút ở 200C trong 20 phút rồi chuyển phần dung dịch phắa trên sang ống eppendorp 1,5ml mới ựược ựánh dấu cùng dòng. Bước 5: ly tâm 12000 vòng/phút ở 200C trong 20 phút, hút dung dịch nổi phắa trên sang ống eppendorp 1,5ml mới ựược ựánh dấu cùng dòng.
Bước 6: cho 500ộl ethanol 96%, trộn ựều sau ựó ly tâm 12000 vòng/phút, trong 200C ở 20 phút. đổ phần dung dịch phắa trên, giữ lại phần kết tủa phắa dưới ựáy ống eppendorp.
Bước 7: rửa kết tủa 3 lần bằng 500ộl ethanol 70%, sau ựó ựể khô ở 370C trong 30 phút.
Bước 8: hòa tan kết tủa bằng 50ộl dung dịch ựệm TE rồi bảo quản trong tủ lạnh -200C.
Sau khi tách chiết DNA, mức ựộ tinh sạch của DNA ựược kiểm tra bằng hai cách
Ớ điện di trên gel agarose 1%
Sau khi tách chiết DNA, chạy ựiện di trên gel agarose 1% ựể kiểm tra sản phẩm DNA của mẫu ựã tách chiết. Sau khi ựiện di xong, nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng Ethidium bromide nồng ựộ 0,5ộg/ml trong 15 phút. Quan sát và phân tắch các vệt băng bằng ựèn UV. Kết quả mẫu có DNA tinh sạch khi cho vệt băng sáng rõ nét, ngược lại mẫu không có DNA khi không thấy xuất hiện vệt băng.
Ớ Kiểm tra trên máy quang phổ kế
Hòa tan DNA của các mẫu với cùng một thể tắch ựệm Tris-EDTA là 0,5ml Lấy 5ộl dung dịch DNA của mỗi mẫu kể trên hòa trong 1ml ựệm TE rồi ựo trên máy (bước này lặp lại 3 lần).
Ghi lại chỉ số về mật ựộ quang học (OD) ở hai bước sóng 260nm, 280nm và tỷ số của hai bước sóng 260/280
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 44 Nồng ựộ DNA ựược tắnh theo công thức sau:
Nồng ựộ DNA = giá trị của chỉ số (OD 260) x 200 x 50ug/ml (giá trị chuẩn)
3.3.4.2 Phản ứng PCR
4 cặp mồi Satt242, Satt309, Satt521, Satt556 ựược sử dụng ựể phân tắch SSR theo Wang and Takahata (2007) . Trình tự 4 cặp mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) ựược trình bày trong bảng 3.1.
Các hóa chất gồm: Tris-HCl, EDTA (Ethylene diaminete traacetic acid), SDS (Sodium dodecyl sulfate: natri dodecyl sulfate). Buffer Dream, dNTP, Taq Dream, Agarose ... (bảng 3.2)
Bảng 3.1: 4 cặp mồi SSR ựược sử dụng trong phòng thắ nghiệm
Chỉ thị SSR Trình tự mồi Nhiệt ựộ gắn mồi (0C) Satt242 F 5Ỗ-GCGTTGATCAGGTCGATTTTTATTTGT -3Ỗ R 5Ỗ-GCGAGTGCCAACTAACTACTTTTATGA-3Ỗ 58 Satt309 F 5Ỗ-GCGCCTACTAATTGGCGTCTT-3Ỗ R 5Ỗ-GCGCCTTAAATAAAACCCGAAACT-3Ỗ 58 Satt521 F 5Ỗ-GCGCTTCACTCTGGTGTAGTGTAG-3Ỗ R 5Ỗ-GCGTTAGATAACGACACATTATTA-3Ỗ 59 Satt556 F 5Ỗ-GCGATAAAACCCGATAAATAA-3Ỗ R 5Ỗ-GCGTTGTGCACCTTGTTTTCT-3Ỗ 55
Phản ứng PCR với tất cả 4 mồi ựược thực hiện trên máy PCR iCyeler, với thể tắch phản ứng 23,84ộl, trong ựó chứa các thành phần phản ứng gồm:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 45
Bảng 3.2: Thành phần các chất tham gia cho 1 phản ứng PCR
Thành phần Nồng ựộ gốc Thể tắch cần lấy (ộl)
H2O 14,5
10X buffer Dream 10X 2
dNTP 10mM 2
Primer Forward 10pmol/ộl 0,12 Primer Reverse 10pmol/ộl 0,12 ADN Taq polymerase 5 unit/ ộl 0,1
ADN khuôn mẫu 5,0
Tổng 23,84 ộl
Ớ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ựối với ựậu tương
Bước 1: nâng nhiệt dộ lên 950C trong 3 phút. Bước 2: tiếp tục giữ ở nhiệt ựộ 950C trong 45 giây. Bước 3: hạ nhiệt ựộ xuống trong khoảng từ 50 Ờ 620C (tùy thuộc mồi) trong 45 giây. Bước 4: nâng nhiệt ựộ lên 720C trong 1 phút. Chạy với 34 chu kỳ từ bước 2 ựến bước 4. Sau ựó kết thúc ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR ựược bảo quản ở -200C.
Ớ Chạy ựiện di kiểm tra sản phẩm PCR
Sau khi kết thúc phản ứng PCR tiến hành ựiện di sản phẩm nhân gen ựối với các dòng ựậu tương ựược chọn lọc bằng agarose 3%. Nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng ethilium bromide nồng ựộ 0,5ộg/ml trong 15 phút. Quan sát và phân tắch các vệt băng bằng ựèn UV.
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu ựược tổng hợp, xử lý bằng phầm mềm Excel 2003 và IRRISTAT 5.0
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 46
PHẦN IV
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. MỘT SỐ đẶC đIỂM HÌNH THÁI, đẶC đIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÁC GIỐNG đẬU TƯƠNG đƯỢC SỬ DỤNG PHÁT TRIỂN CỦA CÁC GIỐNG đẬU TƯƠNG đƯỢC SỬ DỤNG LÀM VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM
Các chỉ tiêu hình thái chủ yếu do bản chất di truyền của giống quyết ựịnh và tạo nên sự ựặc thù của giống này so với giống khác. Do ựó, ựặc ựiểm hình thái ựược sử dụng như là một trong các chỉ tiêu ựể phân biệt các giống. Trong quá trình tiến hành thắ nghiệm, chúng tôi ựã tiến hành theo dõi và mô tả các ựặc ựiểm hình thái và ựặc ựiểm sinh trưởng phát triển của các giống gốc làm căn cứ ựể xác ựịnh sự sai khác giữa giống gốc với các dòng ựột biến. đặc ựiểm hình thái của các giống gốc ựược mô tả cụ thể trong bảng 4.1. và bảng 4.2.
Bảng 4.1 Một số ựặc ựiểm hình thái của các giống gốc tham gia thắ nghiệm
Giống Tắnh trạng
đT12 đT20 đVN6
Màu sắc thân Xanh Tắm Tắm
Dạng hình sinh trưởng Hữu hạn Hữu hạn Hữu hạn
Hình dạng lá Trung gian Rộng Rộng
Màu sắc lá Xanh Xanh ựậm Xanh
Màu sắc hoa Trắng Tắm ựậm Tắm
Màu sắc vỏ quả Xám Nâu Nâu ựậm
Màu sắc hạt Vàng Vàng sáng Vàng
Màu sắc rốn hạt Nâu ựậm Nâu Nâu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 47
Bảng 4.2: đặc ựiểm Sinh trưởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống gốc tham gia thắ nghiệm
Giống
Chỉ tiêu ựánh giá đT12 đT20 đVN6
Vụ hè thu 2010 85 97 88
TGST
Vụ Xuân 2011 99 114 102
Chiều cao cây (cm) 33,4 112,4 38,2
số cành cấp 1 (cành) 3,2 4,2 7,3 Số ựốt hữu hiệu (ựốt) 10,3 11,5 11,1 Tổng số quả/cây (quả) 29,7 34,4 38,8 Tỷ lệ quả chắc (%) 85,2 89,2 85,5 Tỷ lệ quả 1 hạt (%) 19,4 16,3 22,2 Tỷ lệ quả 3 hạt (%) 28,1 36,7 26,4 P1000 (g) 167,5 170,6 175,6 NSCT (g) 9,2 9,8 10,4
Giống đT12 có thời gian sinh trưởng từ 85 ngày (vụ hè) ựến 99 ngày (vụ xuân),hoa trắng, hạt vàng, rốn nâu ựậm, quả chắn có mầu xám. đT.12 có chiều cao cây 33,4 cm, phần cành trung bình với số cành cấp 1 ựạt 3,2 cành, số ựốt hữu hiệu là 10,3 ựốt , số quả chắc trung bình (29,7 quả) , tỷ lệ quả ba hạt cao (28,1%), khối lượng 1000 hạt ựạt 167,5g.
Giống đT20 là giống có sự sinh trưởng phát triển khỏe, thời gian sinh trưởng tương ựối dài với TGST trong vụ xuân là khoảng 114 ngày và vụ hè là 97 ngày, hoa có màu tắm, lá rộng, hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu nâu, khi chắn vỏ quả có màu nâu, số quả/cây 34,4 quả, khối lượng 1.000 hạt là 170g, tỷ lệ quả 3 hạt/cây cao (36,7%).
Giống ựậu tương đVN -6 có thời gian sinh trưởng trung bình, từ 88 (vụ hè) ựến 102 ngày (vụ xuân). Lá có màu xanh ựậm, hoa tắm, vỏ quả chắn nâu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 48 ựậm, hạt vàng, rốn vàng. đVN-6 thấp cây (38,2cm), phân cành mạnh (7,2 cành cấp 1). Trọng lượng 1.000 hạt 175,6g
4.2. NHỮNG BIẾN đỔI Ở CÁC QUẦN THỂ đẬU TƯƠNG XỬ LÝ TIA GAMMA Ở THẾ HỆ M2 GAMMA Ở THẾ HỆ M2
4.2.1. Những biến ựổi vể diệp lục
Nhiều công trình nghiên cứu của hàng loạt tác giả trên thế giới ựã chỉ ra rằng một trong những chỉ số ựể ựánh giá hiệu quả gây ựột biến của các tác nhân khác nhau người ta căn cứ vào tần số ựột biến diệp lục. Tần số ựột biến diệp lục là một căn cứ chuẩn xác ựể ựánh giá ựúng hiệu quả của gây ựột biến của các tác nhân khác nhau.
Trong quá trình tiến hành thắ nghiệm ở thế hệ M2, chúng tôi ựã phát hiện thấy một số dạng biến dị về diệp lục Kết quả ựược trình bày cụ thể trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Các dạng biến dị về diệp lục thu nhận ựược ở thế hệ M2
Các dạng biến dị diệp lục Giống CTTN Khảm lá Bạch tạng Tổng số cá thể M2 theo dõi (cây) Số cá thể biến ựổi (cây) Tần số biến dị diệp lục (%) ự/c 0 0 53 0 0 đT12 21Kr 4 1 475 5 1,05 ự/c 0 0 62 0 0 đT20 21Kr 2 0 524 2 0,38 ự/c 0 0 58 0 0 đVN6 21Kr 2 1 512 3 0,59
Số liệu ở bảng 4.3 cho thấy, các dạng ựột biến diệp lục xuất hiện với tần số khác nhau ở trong cùng một giống và giữa các giống cũng có sự khác biệt ựáng kể.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 49 Tần số biến dị về diệp lục ở các quần thể ựậu tương thế hệ M2 ựược xử lý bằng tia gamma giao ựộng từ 0,38 ựến 1,05%. đối với các giống khác nhau, tần số biến dị diệp lục có sự chênh lệch ựáng kể. Giống đT12 là giống có tần số biến dị diệp lục lớn nhất lên tới 1,05% và thấp nhất là giống đT20 với tần số biến dị là 0,38%. Giống đVN6 có tần số biến dị diệp lục là 0,59%.
Trong các biến dị về diệp lục, chúng tôi phát hiện thấy các kiểu khác nhau: kiểu biến dị lá trắng hoàn toàn (bạch tạng) kiểu này chỉ phát hiện thấy ở giai ựoạn sau khi nảy mầm vài ngày ở giai ựoạn cây mới chỉ có 2 lá sò (hình1.1). Kiểu biến dị này làm cho cây chết ở giai ựoạn còn non. Loại thứ 2 là lá có màu vàng sáng (hình 1.2), loại này lá sau lá sẽ chuyển sang màu xanh và cây vẫn sinh trưởng bình thường, kiểu biến dị xuất hiện những vệt trắng trên lá nhưng với số lượng rất ắt, kiểu biến dị này thường kèm theo lá có nếp nhăn và kìm hãm sinh trưởng (hình 1.3).
Như vậy có thể khẳng ựịnh rằng cùng một tác nhân gây ựột biến nhưng các giống khác nhau sẽ thể hiện mức ựộ mẫn cảm khác nhau. điều này giải thắch mức ựộ chống chịu với ựiều kiện ngoại cảnh của các giống. Giống có khả năng chống chịu tốt sẽ ắt mẫn cảm hơn so với các tác nhân gây ựột biến hơn so với các giống khác. Nếu xếp theo mức ựộ mẫn cảm của các giống với tia gamma ở liều lượng 21Kr, ta có thể xếp theo thứ tự sau: đT12, đVN6, đT20.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 50
Hinh 1.1: Kiểu ựột biến bạch tạng trên giống đT12
Hình 1.2: đột biến lá có màu vàng sáng giống đT12
Hình 1.3: Khảm lá có vệt trắng và nếp nhăn trên giống đVN6 Hình 1. Một số dạng biến dị về diệp lục thu nhận ựược ở thế hệ M2
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 51
4.2.2. Những biến dị về hình thái ở các quần thể ựậu tương xử lý tia gamma thế hệ M2. gamma thế hệ M2.
Ở các giống ựậu tương chúng tôi tiến hành thắ nghiệm loại biến này khá phong phú và tần số của chúng tương ựối cao từ 0,20% ựến 4,88% Chúng tôi phân biệt một số loại biến dị về hình thái sau:
4.2.2.1. Những biến dị ở lá.
Ở các giống ựậu tương ựược xử lý tia gamma liều lượng 21Kr, chúng tôi phát hiện thấy có 2 loại biến dị chắnh ựó là dạng biến dị làm thay ựổi số lượng lá chét trong một lá kép và dạng biến dị làm thay ựổi kắch thước và