3.3.4.1 Quy trình tách chiết DNA
Các mẫu lá non trên cây ở các dòng có kiểu hình khác với giống gốc ựược chọn sao cho các mẫu không bị các bệnh do các nấm, virus hay các bệnh khác có thể gây ảnh hưởng ựến chất lượng của DNA mẫu cần phân tắch sau này.
Quy trình tách chiết DNA tổng số ựược tiến hành theo các bước sau: Bước 1: mỗi dòng lấy 5 lá non ở 5 cây khác nhau giai ựoạn 2 Ờ 3 lá thật, lá non sau khi thu còn tươi ựược giữ trong tủ lạnh sâu -200C trước khi nghiền mẫu
Bước 2: cắt khoảng 2cm mẫu lá cho vào cối, nhỏ 400ộl dung dịch chiết tách DNA (Tris-HCl+SDS+H2O) vào cối sứ rồi lấy chày nghiền mẫu lá cho ựến khi dịch chiết chuyển sang màu xanh (dạng dịch ựồng thể). Sau ựó chuyển sang ống eppendorp 1,5ml ựược ựánh dấu tên dòng..
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 43 Bước 3: ủ mẫu ở 650C trong 15 phút, trong 15 phút tiến hành ựảo 2 lần. Bước 4: bổ sung 200 ộl 5MK-acetate, lắc nhẹ rồi ựể trên ựá trong 30 phút. Sau ựó ly tâm 12000 vòng/phút ở 200C trong 20 phút rồi chuyển phần dung dịch phắa trên sang ống eppendorp 1,5ml mới ựược ựánh dấu cùng dòng. Bước 5: ly tâm 12000 vòng/phút ở 200C trong 20 phút, hút dung dịch nổi phắa trên sang ống eppendorp 1,5ml mới ựược ựánh dấu cùng dòng.
Bước 6: cho 500ộl ethanol 96%, trộn ựều sau ựó ly tâm 12000 vòng/phút, trong 200C ở 20 phút. đổ phần dung dịch phắa trên, giữ lại phần kết tủa phắa dưới ựáy ống eppendorp.
Bước 7: rửa kết tủa 3 lần bằng 500ộl ethanol 70%, sau ựó ựể khô ở 370C trong 30 phút.
Bước 8: hòa tan kết tủa bằng 50ộl dung dịch ựệm TE rồi bảo quản trong tủ lạnh -200C.
Sau khi tách chiết DNA, mức ựộ tinh sạch của DNA ựược kiểm tra bằng hai cách
Ớ điện di trên gel agarose 1%
Sau khi tách chiết DNA, chạy ựiện di trên gel agarose 1% ựể kiểm tra sản phẩm DNA của mẫu ựã tách chiết. Sau khi ựiện di xong, nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng Ethidium bromide nồng ựộ 0,5ộg/ml trong 15 phút. Quan sát và phân tắch các vệt băng bằng ựèn UV. Kết quả mẫu có DNA tinh sạch khi cho vệt băng sáng rõ nét, ngược lại mẫu không có DNA khi không thấy xuất hiện vệt băng.
Ớ Kiểm tra trên máy quang phổ kế
Hòa tan DNA của các mẫu với cùng một thể tắch ựệm Tris-EDTA là 0,5ml Lấy 5ộl dung dịch DNA của mỗi mẫu kể trên hòa trong 1ml ựệm TE rồi ựo trên máy (bước này lặp lại 3 lần).
Ghi lại chỉ số về mật ựộ quang học (OD) ở hai bước sóng 260nm, 280nm và tỷ số của hai bước sóng 260/280
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 44 Nồng ựộ DNA ựược tắnh theo công thức sau:
Nồng ựộ DNA = giá trị của chỉ số (OD 260) x 200 x 50ug/ml (giá trị chuẩn)
3.3.4.2 Phản ứng PCR
4 cặp mồi Satt242, Satt309, Satt521, Satt556 ựược sử dụng ựể phân tắch SSR theo Wang and Takahata (2007) . Trình tự 4 cặp mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) ựược trình bày trong bảng 3.1.
Các hóa chất gồm: Tris-HCl, EDTA (Ethylene diaminete traacetic acid), SDS (Sodium dodecyl sulfate: natri dodecyl sulfate). Buffer Dream, dNTP, Taq Dream, Agarose ... (bảng 3.2)
Bảng 3.1: 4 cặp mồi SSR ựược sử dụng trong phòng thắ nghiệm
Chỉ thị SSR Trình tự mồi Nhiệt ựộ gắn mồi (0C) Satt242 F 5Ỗ-GCGTTGATCAGGTCGATTTTTATTTGT -3Ỗ R 5Ỗ-GCGAGTGCCAACTAACTACTTTTATGA-3Ỗ 58 Satt309 F 5Ỗ-GCGCCTACTAATTGGCGTCTT-3Ỗ R 5Ỗ-GCGCCTTAAATAAAACCCGAAACT-3Ỗ 58 Satt521 F 5Ỗ-GCGCTTCACTCTGGTGTAGTGTAG-3Ỗ R 5Ỗ-GCGTTAGATAACGACACATTATTA-3Ỗ 59 Satt556 F 5Ỗ-GCGATAAAACCCGATAAATAA-3Ỗ R 5Ỗ-GCGTTGTGCACCTTGTTTTCT-3Ỗ 55
Phản ứng PCR với tất cả 4 mồi ựược thực hiện trên máy PCR iCyeler, với thể tắch phản ứng 23,84ộl, trong ựó chứa các thành phần phản ứng gồm:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 45
Bảng 3.2: Thành phần các chất tham gia cho 1 phản ứng PCR
Thành phần Nồng ựộ gốc Thể tắch cần lấy (ộl)
H2O 14,5
10X buffer Dream 10X 2
dNTP 10mM 2
Primer Forward 10pmol/ộl 0,12 Primer Reverse 10pmol/ộl 0,12 ADN Taq polymerase 5 unit/ ộl 0,1
ADN khuôn mẫu 5,0
Tổng 23,84 ộl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ớ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ựối với ựậu tương
Bước 1: nâng nhiệt dộ lên 950C trong 3 phút. Bước 2: tiếp tục giữ ở nhiệt ựộ 950C trong 45 giây. Bước 3: hạ nhiệt ựộ xuống trong khoảng từ 50 Ờ 620C (tùy thuộc mồi) trong 45 giây. Bước 4: nâng nhiệt ựộ lên 720C trong 1 phút. Chạy với 34 chu kỳ từ bước 2 ựến bước 4. Sau ựó kết thúc ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR ựược bảo quản ở -200C.
Ớ Chạy ựiện di kiểm tra sản phẩm PCR
Sau khi kết thúc phản ứng PCR tiến hành ựiện di sản phẩm nhân gen ựối với các dòng ựậu tương ựược chọn lọc bằng agarose 3%. Nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng ethilium bromide nồng ựộ 0,5ộg/ml trong 15 phút. Quan sát và phân tắch các vệt băng bằng ựèn UV.