Việc nghiên cứu Nano bạc ở nước ta còn mới so với nhiều nước tiên tiến trên thế giới song đã thu được nhiều kết quả. Những kết quả đó sớm được đưa vào sản xuất ứng dụng rất hiệu quả.
Nhóm nghiên cứu về công nghệ Nano bạc ở Đại học Quốc gia Hà Nội và công ty KHCN thuộc tập đoàn Bắc Sơn (Hà Nội) do Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Nam đã đi sâu nghiên cứu và ứng dụng các sản phẩm Nano bạc trong lĩnh vực chăm sóc và bảo vệ cây trồng, vệ sinh khử trùng, làm sạch môi trường và chuồng trại chăn nuôi, ao hồ, nuôi trồng thủy sản; làm sạch môi trường các lớp mẫu giáo, nhóm trẻ, sàn nhà, đồ chơi… Một số chế phẩm đã được thị trường và nhà sản xuất rất ưa thích như NaSil 200 (sát khuẩn gia dụng); N 200 ( xử lý môi trường nuôi thủy sản) và một số sản phẩm Nano bạc đang
được ứng dụng bảo vệ cây trồng, đặc biệt là với sản xuất rau, thực phẩm an toàn và trên một số vườn thuốc ở một số nơi như cây Ba Kích, cây cỏ ngọt, và long nhãn, long vải, hạt sen, giúp cho những sản phẩm dùng trong ngành đông y an toàn rất cao.
Nhóm nhà khoa học trẻ Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh dưới sự chủ trì của Tiến sĩ Đậng Mậu Tiến đã nghiên cứu thành công công nghệ Nano bạc để phòng trừ bệnh hạo tôm và bảo quản rau quả. Kết quả cho thấy khả năng diệt tảo và diệt khuẩn của Nano bạc là rất cao : Vibrio Haveyi, Echerichia Coli, Vibrio Anguillarum, V.Fluvialis, V.Parahaemolyticus (là những loài gây bệnh trên tôm). Kết quả thử nghiệm trên tôm thẻ chân trắng tại trại nuôi tôm trường Đại học Nông lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy tôm nuôi trong bể có xử lý Nano bạc thì số tôm sống và phát triển tốt là 85%; ngược lại, tôm nuôi trong bể không xử lý Nano bạc, tôm chết gần 100%; và hoàn toàn không gây hại cho tôm và môi trường. Nano bạc đang được các trại nuôi tôm công nghệ sạch Thái Tuấn và trại nuôi tôm Hoàng Vũ (huyện Bình Đại, Bến Tre)…sử dụng. Những nhà nuôi tôm gọi Nano bạc là “thuốc cứu tôm”. Các vùng sản xuất ở đây còn dùng Nano bạc để xử lý đất trồng các loại rau, quả cho hiệu quả cao, giá thành hạ, và an toàn thực phẩm. Các nhà sản xuất còn cho biết Nano bạc còn có tác dụng nâng cao hiệu suất quang hợp, chất lượng sản phẩm và vẻ đẹp hàng hóa. Hai trung tâm này (Đại học Quốc gia Hà Nội và Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh) đang đẩy mạnh nghiên cứu và ứng dụng Nano bạc vào sản xuất với tốc độ cao và thu được kết quả rất đáng khích lệ.
Ở nước ta, đề tài nano bạc cũng đã bắt đầu được nghiên cứu trong một vài năm gần đây ở một số đơn vị như Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano – ĐHQG TPHCM, Trường Đại học Bách khoa TPHCM, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên... Riêng đối với đề tài chế tạo nano bạc trong latex cao su thiên nhiên, hiện nay có rất ít công trình nghiên cứu về đề tài này. Trên thế giới hiện nay chỉ có một công trình do một nhóm các nhà nghiên cứu ở Malaysia tiến hành với mục đích chứng minh khả năng bảo vệ của cao su thiên nhiên (nhờ sự có mặt của protein) đối với các hạt nano bạc. Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano – ĐHQG TPHCM hiện đang tiến hành một số công trình nghiên cứu chế tạo và phát triển các ứng dụng của nano bạc trong latex cao su thiên nhiên.
PHẦN 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Vi khuẩn
- Vi khuẩn Escherichia coli ATCC® 25922™.
- Vi khuẩn Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 14028™.
3.1.2. Hóa chất và môi trường
- Dung dịch nano bạc 100ppm: Được lấy tại Viện Vật Lí, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
- Môi trường nuôi cấy:
+ Môi trường thịt pepton (MP): Cao thịt 3g Pepton 10g NaCl 5g Nước cất 1000ml.
+ Môi trường MP rắn 2% agar: Bổ sung thêm 20g agar
+ Môi trường MP bán rắn 0,9% agar: Bổ sung thêm 9g agar
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Tủ nuôi cấy vi sinh vật
- Nồi hấp thanh trùng, xuất xứ Trung Quốc - Tủ ấm, xuất xứ Trung Quốc
- Tủ lạnh
- Tủ cấy vô trùng, xuất xứ Trung Quốc - Cân điện tử, xuất xứ Trung Quốc - Máy khuấy từ, xuất xứ Trung Quốc - Máy đo Ph, xuất xứ Trung Quốc - Máy vontex, xuất xứ từ Đức
- Các dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, bình tam giác,
các ống đong, ống hút...
- Các loại que cấy, que trang.
3.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Tại phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian nghiên cứu: 07/12/2013 đến 07/06/2014 3.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xác định được một số đặc điểm của vi khuẩn nghiên cứu. Nội dung 2 : Lựa chọn phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng khuẩn gram âm của nano bạc.
Nội dung 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với vi khuẩn gram âm.
Nội dung 4: Theo dõi khả năng kháng khuẩn gram âm của nano bạc theo thời gian.
3.3. Phương pháp nghiêu cứu
3.3.1. Phương pháp xác định một số đặc điểm của vi khuẩn nghiên cứu.
3.3.1.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram [12].
- Làm vết bôi và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thkiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.
Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1 - 2 giọt cồn 950. Đốt cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây. Cố định vết bôi nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.
- Nhuộm màu:
+ Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước. + Nhuộ;m thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước.
+ Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước.
+ Nhuộm tiếp bằng dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút, rửa nước, để khô. Lần nhuộm này cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm,
nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).
Kết quả: Quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh đen hay tím, Gram âm bắt màu đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).
3.3.1.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
* Nguyên tắc :
Cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịch pha loãng) vào trong hoặc lên trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 đĩa. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp để làm sao trên mỗi đĩa có từ 30 – 300 khuẩn lạc trên đĩa. Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển sau đó đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên [5].
Cách tiến hành :
*Kết quả :
Đếm các khuẩn lạc đã mọc trong các đĩa. Để có kết quả chính xác chỉ tính các đĩa có khoảng 30 – 300 khuẩn lạc.
Pha loãng mẫu
Cấy 0.05 – 0.1ml mẫu lên bề mặt môi trường
Trang đều mẫu trên bề mặt thạch
Đem nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 24h
Đỗ môi trường thạch vào hộp peptri
Số lượng VSV có trong 1ml hay 1g mẫu được tính theo công thức : ΣC
N = (CFU/ml) (n1 + 0,1. n2). f1. V
Trong đó: ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được ở tất cả các đĩa
n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất) n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng liên tiếp) f1: Hệ số pha loãng ở đĩa đếm thứ 1
V: thể tích mẫu cấy ở mỗi hộp petri
3.3.2. .Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn gram âm của nano bạc
3.3.2.1. Phương pháp khuyếch tán sử dụng đĩa giấy
Hoạt tính kháng khuẩn khuẩn được thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa giấy được mô tả:
Đặt trên bề mặt, để tủ lạnh 30 phút Đổ, dàn đều
Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp khuếch tán sử dụng đĩa giấy
3.3.2.2. Phương pháp đục lỗ thạch
Hoạt tính kháng khuẩn khuẩn được thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch được mô tả:
Đĩa giấy: đường
kính 5mm, hấp vô trùng1210C, sấy 1300C/2h Eppendoff chứa 1ml nước deion (kiểm chứng) Eppendoff chứa 1ml nano bạc Eppendoff chứa 1ml kháng sinh (đối chứng)
Đĩa giấy tẩm dung dịch
0,4ml vi sinh vật hoạt hóa 24h + 5ml MPA 450C Đĩa chứa 10ml MPA
Đĩa chứa vi khuẩn Nuôi 370C, 24h quan sát
Hình 3.2. Sơ đồ phương pháp đục lỗ thạch
3.3.2.3. Phương pháp nhỏ dịch kháng khuẩn lên bề mặt thạch
Hoạt tính kháng khuẩn khuẩn được thực hiện theo phương pháp nhỏ dịch kháng khuẩn lên bề mặt thạch được mô tả:
Nano bạc dạng
dung dịch
Nuôi 370C,24h trong môi trường MP lỏng Pha loãng nano bạc
trong nước deionic (DI) với các nồng
độ khác nhau
Trộn vào môi trường MP bán lỏng Vi sinh vật Nhỏ 100µl dịch nano bạc vào lỗ thạch Giữ trong tủ lạnh 40C , 8h Đục lỗ thạch có đường kính d=5mm
Chuyển sang tủ ấm 370C, nuôi 24h
Nhỏ lên bề mặt Nhỏ lên
các vết dịch kháng khuẩn
Hình 3.3. Sơ đồ phương pháp nhỏ dịch kháng khuẩn lên bề mặt thạch
3.3.2.4. Phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng
Hoạt tính kháng khuẩn khuẩn được thực hiện theo phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng được mô tả:
Hình 3.4. Sơ đồ phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng
3.3.3. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với vi khuẩn gam âm. đối với vi khuẩn gam âm.
Các ống nghiệm chứa 0,5ml dung dịch MP đã được chuẩn bị, hấp tiệt trùng ở 1210C. Đĩa thạch 0.01ml vi sinh vật hoạt hóa 24h Đặt vào tủ ấm, 370C, sau 24h quan sát 0.05ml dịch nano bạc ở các nồng
độ, kiểm chứng là nước deion
Đĩa thạch có các vết dịch kháng khuẩn 0,1ml vi sinh vật hoạt hóa 24h, định lương mật độ vi sinh vật Ống chứa 0,5ml MP Dịch A nuôi 370C
Sau 24h, quan sát pha loãng định lượng vi sinh vật
0,4ml nano bạc ở các nồng độ, kiểm chứng
Vi sinh vật hoạt hóa 24h, sau đó pha loãng huyền phù dịch vi khuẩn bằng MP theo phương pháp pha loãng liên tiếp đến khi mật độ vi sinh vật đạt 105 CFU/ml (huyền dịch A).
Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch vi khuẩn A, 0,4ml nano bạc ở các nồng độ khác nhau là C1=100 ppm, C2=50 ppm, C3=25 ppm, C4=12,5 ppm, C5=6,25 ppm, C6=3,125 ppm; C7=1,5625 ppm. ( kiểm chứng là nước deion) với 0,5ml môi trường trong ống nghiệm. Sau 24h nuôi cấy tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật còn sống sót trong dịch trộn.
3.3.4. Phương pháp theo dõi khả năng kháng khuẩn gram âm của nano bạc theo thời gian bạc theo thời gian
Nano bạc được bổ sung 0,5ml môi trường MP cùng với 0,1ml huyền dịch vi sinh vật với các nồng độ sau khi tính lại lần lượt là 1×MIC, 2×MIC, 4×MIC. Sau thời gian 4, 12, 16, 20, 24, 36, 48 60, 72 giờ kể từ thời điểm bắt đầu trộn, định lượng mật độ vi sinh vật còn sống sót.
3.3.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
3.3.5.1. Phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng
Vi sinh vật được hoạt hóa trong môi trường MP, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24h, 37oC , giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo, cấy chuyển giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ hai tuần một lần [8].
3.3.5.2. Phương pháp bảo quản trong dung dịch 10% glycerol
Vi sinh vật được nuôi trong MP, cấy chuyển sang đĩa thạch nuôi 24h, 37oC, khuẩn lạc mọc lên được cào và giữ giống trong eependoff chứa 1ml MP
đã được bổ sung 10% glycerol vô trùng. Bảo quản – 20oC. Phương pháp này giúp bảo quản giống trong vòng 1-2 năm.
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 2 lần và được xử lí thống kê theo phần mềm Excel. Sai số trong phép định lượng được tính toán trong excel, sử dụng công thức sai số toàn phương trung bình.
Mật độ vi sinh vật A = Ā ± δ ( log CFU/ml) Trong đó : δ: Sai số toàn phương trung bình
Ā : Mật độ vi sinh vật trung bình (log CFU/ml)
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định một số đặc điểm của vi khuẩn nghiên cứu
Escherichia coli và S. Typhimurium là những vi khuẩn rất nhảy cảm,
phụ thuộc rất nhiều yếu tố về đặc điểm hình thái, tính chất, mật độ tế bào. Để lựa chọn được phương pháp thích hợp xác định khả năng kháng khuẩn
Escherichia và vi khuẩn S. Typhimurium của nano bạc thì việc xác định một
số đặc điểm của vi khuẩn nghiên cứu là điều kiện cần có cho quá trình thực hiện thí nghiệm. Vì vậy để xác định được một số đặc điểm của vi khuẩn nghiên cứu chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo mục 3.3.1. Kết quả xác định một số khuẩn được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Một số đặc điểm của vi khuẩn nghiên cứu
Vi khuẩn Môi trường nuôi cấy điển hình Đặc điểm khuẩn lạc Mật độ vi sinh vật sau 24h hoạt hóa (CPU/ml)
Escherichia coli MP Là loại khuẩn lạc hình gậy ngắn, hai đầu tròn, màu trắng đục.
108
S. Typhimurium MP Là loại khuẩn lạc hình gậy, mập, ngắn, hai đầu hơi tròn, màu vàng nhạt, hơi trong.
108
4.2. Lựa chọn phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng khuẩn
Nano bạc với năng lượng bề mặt lớn có khả năng giải phóng từ từ các ion bạc vào trong dung dịch, nhờ vậy nano bạc có hiệu lực khử khuẩn mạnh hơn rất nhiều lần và kéo dài hơn so với các bạc ở dạng keo, dạng ion hay dạng rắn [27]. Tuy nhiên khả năng kháng khuẩn của nano bạc lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước, hìn dạng, nồng độ. Vì vậy việc xác định khả
năng kháng khuẩn gặp nhiều khó khăn. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu lựa chọn phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng khuẩn Escherichia
coli và vi khuẩn S.Typhimurium. Kết quả nghiên cứu thể hiện trên hình 4.2a
và bảng 4.2a.
a) b)
c) d)
Hình 4.1a. Xác định khả năng kháng E.coli của nano bạc bằng các phương pháp khác nhau
a) Phương pháp nhỏ dịch kháng khuẩn lên bề mặt thạch b) Phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng c) Phương pháp khuếch tán sử dụng đĩa giấy
d) Phương pháp đục lỗ thạch
a)
a) b)
c) d)
Hình 4.1b. Xác định khả năng kháng Salmonella của nano bạc bằng các phương pháp khác nhau
a) Phương pháp nhỏ dịch kháng khuẩn lên bề mặt thạch b) Phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng c) Phương pháp khuếch tán sử dụng đĩa giấy
d) Phương pháp đục lỗ thạch
Bảng 4.2. Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn
Phương pháp Đặc điểm
Phương pháp nhỏ dịch kháng khuẩn lên bề mặt thạch
Trên mặt thạch có các vết dịch kháng khuẩn
Phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng
Dịch nuôi cấy bị đục, định lượng được vi sinh vật sau kháng
Phương pháp khuyếch tán sử dụng đĩa giấy
Xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy
Phương pháp đực lỗ thạch Xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch
Qua kết quả trên hình 4.1a, 4.1b và bảng 4.2 cho thấy trong 4 phương pháp đều xác định được khả năng kháng khuẩn của nano bạc, tuy nhiên dù điều kiện phòng thí nghiệm, điều kiện thiết bị và thời gian hạn chế nên việc thực hiện và quan sát các phương pháp khuếch tán sử dụng đĩa giấy, phương pháp đục lỗ thạch rất khó quan sát được vòng kháng khuẩn của nano bạc đối