3.3.1.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram [12].
- Làm vết bôi và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thkiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.
Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1 - 2 giọt cồn 950. Đốt cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây. Cố định vết bôi nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.
- Nhuộm màu:
+ Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước. + Nhuộ;m thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước.
+ Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước.
+ Nhuộm tiếp bằng dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút, rửa nước, để khô. Lần nhuộm này cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm,
nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).
Kết quả: Quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh đen hay tím, Gram âm bắt màu đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).
3.3.1.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
* Nguyên tắc :
Cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịch pha loãng) vào trong hoặc lên trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 đĩa. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp để làm sao trên mỗi đĩa có từ 30 – 300 khuẩn lạc trên đĩa. Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển sau đó đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên [5].
Cách tiến hành :
*Kết quả :
Đếm các khuẩn lạc đã mọc trong các đĩa. Để có kết quả chính xác chỉ tính các đĩa có khoảng 30 – 300 khuẩn lạc.
Pha loãng mẫu
Cấy 0.05 – 0.1ml mẫu lên bề mặt môi trường
Trang đều mẫu trên bề mặt thạch
Đem nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 24h
Đỗ môi trường thạch vào hộp peptri
Số lượng VSV có trong 1ml hay 1g mẫu được tính theo công thức : ΣC
N = (CFU/ml) (n1 + 0,1. n2). f1. V
Trong đó: ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được ở tất cả các đĩa
n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất) n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng liên tiếp) f1: Hệ số pha loãng ở đĩa đếm thứ 1
V: thể tích mẫu cấy ở mỗi hộp petri