2.2.2.1. Quy trình dự kiến
Quy trình dự kiến thủy phđn chitin, chitosan bằng enzyme hemicellulase như sau:
Chitin được lăm mềm bằng câch tâc dụng với NaOH loêng, sau đó tiếp tục tâc dụng với HCl loêng vă hòa tan chitosan bằng câch tâc dụng với acid acetic loêng. Sau đó đưa chitin, chitosan thủy phđn bằng enzyme hemicellulase, trong công
đoạn thủy phđn kiểm soât câc thông số: Nồng độ enzyme, nồng độ chitin, chitosan, nhiệt độ, pH vă thời gian thủy phđn. Sản phẩm thủy phđn thu được ở dạng lỏng nín tiến hănh sấy phun thu được COS dạng bột mịn.
Hình 2.4: Sơđồ quy trình dự kiến thủy phđn chitin, chitosan bằng enzyme
hemicellulase
Từ quy trình hình 2.4 tiến hănh nghiín cứu câc thông số cần thiết cho quy trình
Chitin bột
Hòa tan
Thủy phđn
Đun câch thủy
Lọc - Nồng độ enzyme - Nồng độ chitin, chitosan. - Nhiệt độ - pH. - Thời gian. Lăm mềm Chitosan bột Sấy phun COS
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xâc định câc thông số của quy trình
Xâc định ảnh hưởng nhiệt độ đến quâ trình thủy phđn
Hình 2.5: Sơđồ thí nghiệm xâc định ảnh hưởng nhiệt độ đến quâ trình thủy phđn
Căn cứ văo phương phâp thăm dò cổ điển kết hợp với công trình nghiín cứu của Aiba vă Muraki (1996) về hemicellulase thủy phđn chitin, chitosan. Trong công đoạn khảo sât ảnh hưởng của nhiệt độ đến quâ trình thủy phđn, tâc giả luận văn tiến t = 390C ± 0.50C t = 350C ± 0.50C
COS
Kiểm tra chất lượng cảm quan Kiểm tra hiệu suất
Xâc định nhiệt độ thủy phđn thích hợp Thủy phđn
Hòa tan
Sản phẩm thủy phđn
Sấy phun Đun câch thủy
Lọc Thủy phđn - pH = 5
- Thời gian: 6 ngăy - Nồng độ enzyme 2%
Chitosan bột
t =370C ± 0.50C
Sản phẩm thủy phđn
Sấy phun Đun câch thủy
Lọc Lăm mềm
hănh khảo sât nhiệt độ từ 35 ÷ 390C, tại pH = 5 vă thời gian lă 6 ngăy vă nồng độ enzyme lă 2% so với cơ chất. Tiến hănh thí nghiệm theo phương phâp thống kí sinh học, mỗi thí nghiệm tiến hănh ba lần, mỗi lần 3 mẫu. Kết quả lă trung bình cộng của câc lần thí nghiệm. Để chọn thông số thủy phđn thích hợp tâc giả căn cứ văo chất lượng cảm quan vă hiệu suất của quy trình.
Xâc định ảnh hưởng nồng độ enzyme đến quâ trình thủy phđn
Hình 2.6: Sơđồ thí nghiệm xâc định ảnh hưởng nồng độ enzymeđến quâ trình
thủy phđn
[Enzyme]=3% [Enzyme]=1%
COS
Kiểm tra hiệu suất
Xâc định nồng độ enzyme thủy phđn thích hợp Thủy phđn
Sản phẩm thủy phđn
Sấy phun Đun câch thủy
Lọc Thủy phđn - pH = 5
- Thời gian: 6 ngăy - Nhiệt độ thích hợp
[Enzyme]=2%
Sản phẩm thủy phđn
Sấy phun Đun câch thủy
Lọc
Hòa tan Chitosan bột
Lăm mềm Chitin bột
Căn cứ văo phương phâp thăm dò cổ điển kết hợp với công trình nghiín cứu của Aiba vă Muraki (1996) về hemicellulase thủy phđn chitin, chitosan. Trong công đoạn khảo sât ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quâ trình thủy phđn, tâc giả tiến hănh khảo sât nồng độ [enzyme] từ 1÷3% so với cơ chất, tại pH = 5, thời gian lă 6 ngăy tại nhiệt độ thích hợp xâc định theo quy trình hình 2.5. Tiến hănh thí nghiệm theo phương phâp thống kí sinh học, mỗi thí nghiệm tiến hănh ba lần, mỗi lần 3 mẫu. Kết quả lă trung bình cộng của câc lần thí nghiệm. Để chọn thông số thủy phđn thích hợp tâc giả căn cứ văo chất lượng cảm quan vă hiệu suất của quy trình.
Xâc định ảnh hưởng pH đến quâ trình thủy phđn
Hình 2.7: Sơ đồ thí nghiệm xâc định pH cho quâ trình thủy phđn
pH = 5.5 pH = 4.5
COS
Kiểm tra chất lượng cảm quan Kiểm tra hiệu suất
Xâc định pH thủy phđn thích hợp Thủy phđn
Sản phẩm thủy phđn
Sấy phun Đun câch thủy
Lọc Thủy phđn - [Enzyme] thích hợp
- Thời gian: 6 ngăy - Nhiệt độ thích hợp
pH = 5
Sản phẩm thủy phđn
Sấy phun Đun câch thủy
Lọc
Hòa tan Chitosan bột
Lăm mềm Chitin bột
Căn cứ văo phương phâp thăm dò cổ điển kết hợp với công trình nghiín cứu của Aiba vă Muraki (1996) về hemicellulase thủy phđn chitin, chitosan. Trong công đoạn khảo sât ảnh hưởng của pH đến quâ trình thủy phđn, tâc giả tiến hănh khảo sât pH = 4.5÷5.5, thời gian lă 6 ngăy, chọn [enzyme] vă nhiệt độ thích hợp theo quy trình hình 2.5; 2.6. Tiến hănh thí nghiệm theo phương phâp thống kí sinh học, mỗi thí nghiệm tiến hănh ba lần, mỗi lần 3 mẫu. Kết quả lă trung bình cộng của câc lần thí nghiệm. Để chọn thông số thủy phđn thích hợp tâc giả căn cứ văo chất lượng cảm quan vă hiệu suất của quy trình.
Xâc định ảnh hưởng thời gian đến quâ trình thủy phđn
Hình 2.8: Sơđồ thí nghiệm xâc định ảnh hưởng thời gian đến quâ trình thủy phđn
= 3
COS
Kiểm tra chất lượng cảm quan Kiểm tra hiệu suất
Xâc định thủy phđn thích hợp Thủy phđn
Sản phẩm thủy phđn
Sấy phun Đun câch thủy
Lọc Thủy phđn - pH thích hợp - Nhiệt độ thích hợp - [Enzyme] thích hợp Sản phẩm thủy phđn Sấy phun Đun câch thủy
Lọc Hòa tan Chitosan bột Lăm mềm Chitin bột = 4 = 5 = 6
Căn cứ văo phương phâp thăm dò cổ điển kết hợp với công trình nghiín cứu của Aiba vă Muraki (1996). Trong công đoạn khảo sât ảnh hưởng thời gian đến quâ trình thủy phđn, tâc giả luận văn khảo sât thời gian từ 3-6 ngăy, pH; nhiệt độ; [enzyme] thích hợp theo quy trình hình 2.5; 2.6; 2.7. Tiến hănh thí nghiệm theo phương phâp thống kí sinh học, mỗi thí nghiệm tiến hănh ba lần, mỗi lần 3 mẫu. Kết quả lă trung bình cộng của câc lần thí nghiệm. Để chọn thông số thủy phđn thích hợp tâc giả căn cứ văo chất lượng cảm quan vă hiệu suất thu hồi của quy trình.
2.2.2.3. Bố trí thí nghiệm sử dụng COS bảo quản sữa bò tươi nguyín liệu
Hình 2.9: Sơ đồ thí nghiệm xâc định nồng độ COS trong bảo quản sữa bò tươi
nguyín liệu Không sử dụng COS (Mẫu đối chứng) Sử dụng COS ở câc nồng độ khâc nhau Nhiệt độ: 6-80C Thời gian: 48 giờ
0,4% 03%
0,2% 0,1%
Nhiệt độ: 6-80C Thời gian: 48 giờ
Sữa bò tươi Kiểm tra chất lượng
Sau khi mua sữa bò tươi ở trại mang về phòng thí nghiệm đânh giâ cảm quan (mău sắc, mùi vị vă trạng thâi), câc chỉ tiíu lý - hoâ (hăm lượng chất khô, hăm lượng chất bĩo, tỷ trọng của sữa, tạp chất lạ nhìn thấy bằng mắt thường), vă câc chỉ tiíu vi sinh (tổng số vi sinh vật hiếu khí, E.coli, S.aureus, Coliforms, Salmonella).
Sau đó, sữa được bảo quản bằng COS ở những nồng độ khâc nhau (0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%), tại nhiệt độ 6÷80C, thời gian 48 giờ. Trong quâ trình bảo quản, cứ 24 giờ mang mẫu đânh giâ lại chỉ tiíu cảm quan, chỉ số peroxyt vă chỉ tiíu vi sinh. Từ đó xâc định nồng độ COS phù hợp cho bảo quản sữa tươi nguyín liệu. Đối với mẫu đối chứng cũng kiểm tra câc chỉ tiíu tương tự nhưng không bổ sung COS văo.
2.2.3.Thiết bị, dụng cụ, hoâ chất sử dụng nghiín cứu
Hóa chất: Câc loại hoâ chất sử dụng trong thí nghiệm do Đức vă Mỹ cung cấp. Dụng cụ
- Pipet, ống đong. - Bình tam giâc, bếp gas
- Cốc thủy tinh, bình định mức
Thiếi bị
- Bể ổn nhiệt, thiết bị sấy phun - Nhiệt kế, mây đo pH.
- Cđn điện tử, tủ lạnh, khúc xạ kế. - Thiết bị tâch bơ,
- Mây đo độ nhớt, mây so mău. - Mây ly tđm, tỷ trọng kế.
- Thiết bị xâc định nhanh lipit sữa.
2.2.4. Phương phâp xử lý số liệu
Xử lý số liệu nghiín cứu theo phương phâp thống kí sinh học, mỗi thí nghiệm tiến hănh ba lần, mỗi lần 3 mẫu. Kết quả lă trung bình cộng của câc lần thí nghiệm.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU VĂ THẢO LUẬN 3.1. XÂC ĐỊNH CÂC THÔNG SỐ THỦY PHĐN CHITIN-CHITOSAN 3.1.1. Xâc định nhiệt độ thích hợp cho quâ trình thủy phđn chitin-chitosan
Chitin-chitosan thủy phđn bằng enzyme hemicellulase ở cùng điều kiện: nồng độ enzyme 2% so với cơ chất; pH = 5; thời gian (τ): 6 ngăy vă câc điều kiện nhiệt độ khâc nhau (350C, 370C, 390C). Trong quâ trình thủy phđn thường xuyín khuấy đảo vă kiểm tra pH, nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ vă pH ổn định trong quâ trình thuỷ phđn. Dung dịch sau thủy phđn mang đi đun câch thủy đình chỉ hoạt động của enzyme vă tăng nồng độ chất khô, sau đó đem lọc, dịch lọc thu được sấy phun ở nhiệt độ 1600C ta thu được COS. Tiến hănh đânh giâ cảm quan vă hiệu suất thu hồi COS. Kết quả nghiín cứu thể hiện ở hình 3.1 vă 3.2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 35 37 39 Nhiệt độ oC
Hiệu suất thu COS (%)
Chitin Chitosan
15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 35 37 39 Nhiệt độ (oC) ĐCQ - chung Chitin Chitosan
Từ kết quả nghiín cứu thể hiện ở hình 3.1; 3.2 cho thấy: Đới với cơ chất
chitosan: Tại nhiệt độ t = 350C, hiệu suất thu chito-COS lă 67.3% vă ĐCQ-chung lă 16.5. Tại nhiệt độ t = 370C, hiệu suất thu chito-COS lă 77.8% vă ĐCQ-chung lă
17.4. Tại nhiệt độ t = 390C, hiệu suất thu chito-COS lă 75.7% vă ĐCQ-chung lă 17.0. Đối với cơ chất chitin: Tại nhiệt độ t = 350C, hiệu suất thu chiti-COS lă
55.7% vă ĐCQ-chung lă 15.8. Tại nhiệt độ t = 370C, hiệu suất thu chiti-COS lă
66.4% vă ĐCQ-chung lă 16.5. Tại nhiệt độ t = 390C, hiệu suất thu thu chiti-COS lă 63.7% vă ĐCQ-chung lă 16.0. Như vậy, tại t = 370C hiệu suất thu COS vă ĐCQ- chung lă cao nhất vă t = 350C hiệu suất thu COS vă ĐCQ-chung lă thấp nhất. Kết quả năy cũng phù hợp với công trình nghiín cứu của Aiba vă Muraki (1996,1997)[52] cho rằng hemicellulase thủy phđn chitin-chitosan ở t = 370C lă tốt nhất. Có thể 370C lă nhiệt độ thích hợp cho enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ
Aspergillus niger hoạt động nín hoạt tính enzyme hemicellulase tại đđy mạnh nhất vă cho sản phẩm cao nhất. Tóm lại, t = 370C lă nhiệt độ thích hợp cho enzyme hemicellulase thủy phđn chitin-chitosan.
3.1.2. Xâc định nồng độ enzyme thích hợp cho quâ trình thủy phđn chitin- chitosan.
Chitin-chitosan thủy phđn bằng enzyme hemicellulase ở cùng điều kiện: nhiệt độ = 370C; pH = 5; thời gian: 6 ngăy vă câc nồng độ enzyme khâc nhau (1%, 2%, 3%). Trong quâ trình thủy phđn thường xuyín khuấy đảo vă kiểm tra pH, nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ vă pH ổn định trong quâ trình thuỷ phđn. Dung dịch sau thủy phđn mang đi đun câch thủy đình chỉ hoạt động của enzyme vă tăng nồng độ chất khô, sau đó đem lọc, dịch lọc thu được sấy phun ở nhiệt độ 1600C ta thu được COS. Tiến hănh đânh giâ cảm quan vă hiệu suất thu hồi COS. Kết quả nghiín cứu thể hiện ở hình 3.3 vă 3.4. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1% 2% 3% Nồng độ enzyem (%)
Hiệu suất thu COS (%)
Chitin Chitosan
Từ kết quả nghiín cứu thể hiện ở hình 3.3 vă 3.4 cho thấy: Đối với chitosan:
Tại nồng độ enzyme 1%, hiệu suất thu chito-COS lă 70.4% vă ĐCQ-chung lă 17.9.
Tại nồng độ enzyme 2%, hiệu suất thu chito-COS lă 81.1% vă ĐCQ-chung lă 18.7.
Tại nồng độ enzyme 3%, hiệu suất thu chito-COS lă 81.2% vă ĐCQ-chung lă 18.0.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1% 2% 3% Nồng độ enzyme (%) ĐCQ - chung Chitin Chitosan
Hình 3.4: ĐCQ - chung của COS theo nồng độ enzyme
Đối với chitin: Tại nồng độ enzyme 1%, hiệu suất thu chiti-COS lă 58.4% vă
ĐCQ-chung lă 15.4. Tại nồng độ enzyme 2%, hiệu suất thu chiti-COS lă 69.7% vă ĐCQ-chung lă 16.0. Tại nồng độ enzyme 3%, hiệu suất thu chiti-COS lă 70.2% vă ĐCQ-chung lă 16.0. Kết quả cho thấy, nồng độ enzyme từ 2% ÷ 3% cho hiệu suất thu COS vă ĐCQ-chung gần bằng nhau vă cao hơn ở nồng độ enzyme 1%. Điều năy có thể do nồng độ enzyme căng cao thì hiệu suất thu nhận sản phẩm căng cao nhưng khi nồng độ enzyme bêo hòa với nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng không thay đổi[3]. Như vậy, nồng độ enzyme 2% so với cơ chất lă thích hợp để thủy phđn
chitin-chitosan.
3.1.3. Xâc định pH thích hợp cho quâ trình thủy phđn chitin-chitosan
Chitin-chitosan thủy phđn bằng enzyme hemicellulase ở cùng điều kiện: nhiệt độ = 370C; thời gian: 6 ngăy; nồng độ enzyme: 2% so với cơ chất vă câc điều kiện pH khâc nhau (4,5; 5; 5.5). Trong quâ trình thủy phđn thường xuyín khuấy đảo vă kiểm tra pH, nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ vă pH ổn định trong quâ trình thuỷ phđn. Dung dịch sau thủy phđn mang đi đun câch thủy đình chỉ hoạt động của enzyme vă tăng nồng độ chất khô, sau đó đem lọc, dịch lọc thu được sấy phun ở
nhiệt độ 1600C ta thu được COS. Tiến hănh đânh giâ cảm quan vă hiệu suất thu hồi COS. Kết quả nghiín cứu thể hiện ở hình 3.5 vă 3.6.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 4.5 5 5.5 pH
Hiệu suất thu COS (%)
Chitin Chitosan 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 4.5 5 5.5 pH ĐCQ - chung Chitin Chitosan
Từ kết quả nghiín cứu thể hiện ở hình 3.5, 3.6 cho thấy: Đối với chitosan:
Tại pH = 4.5, hiệu suất thu chito-COS lă 71.3% vă ĐCQ-chung lă 17.0. Tại pH = 5,
hiệu suất thu chito-COS lă 73.8% vă ĐCQ-chung lă 17.6. Tại pH = 5.5, hiệu suất thu chito-COS lă 70.5% vă ĐCQ-chung lă 17.0. Đối với chitin: Tại pH = 4,5, hiệu suất thu chiti-COS lă 60.5% vă ĐCQ-chung lă 15.8. Tại pH = 5, hiệu suất thu chiti-
Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thu COS.
COS lă 63.2% vă ĐCQ-chung lă 16.2. Tại pH = 5.5, hiệu suất thu chiti-COS lă 61.7% vă ĐCQ-chung lă 16.2. Nhìn chung, tại pH = 5 cho hiệu suất thu COS vă ĐCQ-chung lă cao nhất vă tại pH = 5,5 cho hiệu suất thu COS vă ĐCQ-chung lă thấp nhất. Điều năy có thể do: tại pH = 5 thích hợp cho enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ Aspergillus niger hoạt động nín hoạt tính enzyme hemicellulase tại đđy mạnh nhất vă cho sản phẩm cao nhất. Tóm lại pH=5 lă thích hợp cho enzyme
hemicellulase thủy phđn chitin-chitosan.
3.1.4. Xâc định thời gian thích hợp cho quâ trình thủy phđn chitin-chitosan.
Chitin-chitosan thủy phđn bằng enzyme hemicellulase ở cùng điều kiện: nhiệt độ = 370C; nồng độ enzyme: 2%; pH = 5 vă thời gian thủy phđn khâc nhau (3ngăy; 4ngăy; 5ngăy; 6ngăy). Trong quâ trình thủy phđn thường xuyín khuấy đảo vă kiểm tra pH, nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ, pH ổn định trong quâ trình thuỷ phđn. Dịch sau khi thủy phđn mang đi đun câch thủy đình chỉ hoạt động của enzyme vă tăng nồng độ chất khô, sau đó đem lọc, dịch lọc thu được sấy phun ở nhiệt độ 1600C ta thu được COS. Tiến hănh đânh giâ cảm quan vă hiệu suất thu COS. Kết quả thể hiện ở hình 3.7; 3.8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 3 4 5 6
Thời gian (ngăy)
Hiệu suất thu COS (%)
Chitin Chitosan
0 5 10 15 20 3 4 5 6
Thời gian (ngăy)
ĐCQ - chung
Chitin Chitosan
Từ kết quả nghiín cứu thể hiện ở hình 3.7 vă 3.8 cho thấy: Đối với cơ chất
chitosan: Sau 3 ngăy thủy phđn, hiệu suất thu chito-COS lă 66.5%. Sau 4 ngăy thủy phđn, hiệu suất thu chito-COS lă 74.3%. Sau 5 ngăy thủy phđn, hiệu suất thu chito- COS lă 79.3%. Sau ngăy thứ 6, hiệu suất thu chito-COS lă 78.3%. Đối với cơ chất
chitin. Sau 3 ngăy thủy phđn, hiệu suất thu chiti-COS lă 54.8%. Sau 4 ngăy thủy phđn, hiệu suất thu chiti-COS lă 61.6%. Sau 5 ngăy thủy phđn, hiệu suất thu chiti- COS lă 68.3%. Sau ngăy thứ 6, hiệu suất thu chiti-COS lă 66.3%. Qua số liệu cho thấy, từ ngăy thứ 3 đến ngăy thứ 5 hiệu suất thu COS tăng theo thời gian thủy phđn nhưng đến ngăy thứ 6 thì hiệu suất thu COS lại giảm. Vă hiệu suất thu COS cao