1.6.1. Giới thiệu chung về enzyme
Hầu hết câc phản ứng hoâ học xảy ra trong tế băo sống đều do enzyme xúc tâc. Enzyme lă những protein có khả năng xúc tâc đặc hiệu cho câc phản ứng hoâ học. Chúng không những có khả năng xúc tâc cho câc phản ứng xảy ra trong tế băo sống, mă sau khi tâch khỏi tế băo chúng vẫn có thể xúc tâc cho câc phản ứng hóa học. Mặt khâc, enzyme còn có hoạt lực xúc tâc cao gấp hăng trăm hăng nghìn lần so với câc chất xúc tâc vô cơ thông thường [4],[5],[10].
Ví dụ: Trong phản ứng thủy phđn sacaroza nếu dùng sacaraza lăm chất xúc tâc thì tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2.1012 lần so với khi dùng axit lăm chất xúc tâc.
Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loêng nhưng không tan trong dung môi không phđn cực. Khi hòa tan enzyme văo nước, câc phđn tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với câc ion, câc nhóm ion hoặc câc nhóm phđn cực trong phđn tử enzyme tạo thănh lớp vỏ hydrat. Lượng nước hydrat năy khâ lớn vă có vai trò quan trọng lă lăm môi trường cho câc phản ứng sinh hoâ.[3].
Enzyme cũng bị kết tủa bởi câc tâc nhđn gđy kết tủa protein. Câc tâc nhđn vật lý vă hóa học lăm biến tính protein thì cũng lăm biến tính enzyme vì vậy enzyme cũng bị mất hoạt tính khi bị tâc động bởi câc tâc nhđn gđy biến tính protein như nhiệt độ cao, axit hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng.
Enzyme lă chất xúc tâc sinh học, do đó trước tiín chúng mang đầy đủ câc đặc điểm của chất xúc tâc nói chung. Phương trình phản ứng enzyme như sau:
Trong đó:
E: Enzyme; S: cơ chất; ES: Phức hợp enzyme – cơ chất; P: Sản phẩm. Enzyme tâc dụng vă chuyển hoâ cơ chất trải qua ba giai đoạn:
Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất tạo thănh phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh vă đòi hỏi năng lượng thấp.
Giai đoạn II: Lă giai đoạn tạo phức chất hoạt hoâ, đđy lă giai đoạn xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tâc dụng của một số nhóm chức trong trung tđm hoạt động của enzyme vă lăm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thănh hoạt động, một số liín kết trong cơ chất bị kĩo căng ra vă mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
Giai đoạn III: Lă giai đoạn tạo ra sản phẩm vă giải phóng enzyme, đđy lă giai đoạn cuối của quâ trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ hình thănh sản phẩm vă enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu[3]
Enzyme có trong mọi tế băo của động vật, thực vật vă vi sinh vật. Do vậy người ta có thể thu nhận enzyme từ câc nguồn năy để sử dụng trong công nghiệp. Một số nguyín liệu dùng để tâch chiết enzyme lă. [3],[4]
Từ thực vật: nhựa đu đủ tâch papain, hạt đậu tương tâch urease, thđn vă quả dứa tâch bromelain ,….
Từ động vật: Từ một số mô vă cơ quan động vật người ta có thể thu nhận nhiều enzyme khâc nhau như từ dạ dăy có thể thu được pepsin, từ tụy tạng thu được trypsin,….
Từ vi sinh vật: Vi sinh vật thường dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm nhiều loại: Aspergillus, Baccillus, Pencillium, Clostridium, Streptomyces vă câc loại nấm men. Vi sinh vật lă đối tượng thích hợp nhất để sản xuất enzyme[5, 10]. Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyne có những ưu điểm sau:
- Có thể chủ động quâ trình sản xuất.
- Chu kỳ sinh trưởng phât triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ vi sinh vật trong một thời gian ngắn từ 36-60giờ.
- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn.
- Giâ thănh câc chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với câc chế phẩm enzyme từ câc nguồn khâc. Vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền.
1.6.2 Một số nghiín cứu vă ứng dụng của enzyme hemicellulase. 1.6.2.1. Một số nghiín cứu của enzyme hemicellulase. 1.6.2.1. Một số nghiín cứu của enzyme hemicellulase.
Hemicellulase lă một hỗn hợp câc enzyme thủy phđn bao gồm: Xylan endo -1,3--xylosidase, EC 3.2.1.32; xylan 1,4--xylosidase, EC 3.2.1.37; vă -L- arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55; Hemicellulase hoạt động tốt ở pH = 4,5÷5,5 vă nhiệt độ dưới 500C. [59],[60]
Hemicellulase lă một enzyme thủy phđn hemicellulose. Hemicellulose lă một dạng của polysaccharides, hemicellulose có mặt ở thănh tế băo, kĩm bền, có thể bị thủy phđn bởi dung dịch acid yếu vă kiềm.
Hemicellulase lă một hỗn hợp enzyme có thể thủy phđn những thănh phần khó tiíu hóa của mô thực vật. Nó sẽ tấn công văo hemicellulose vă giải phóng ra những phđn tử có trọng lượng phđn tử nhỏ hơn[60].
1.6.2.2. Một số ứng dụng của enzyme hemicellulase
Hemicellulase có khả năng thủy phđn chitosan có độ deacetyl trín 22%, trong điều kiện pH = 4,5, nhiệt độ 370C vă sản phẩm thu được lă (C6H11O4N).n, với n = 1,2,3,4,5,6,7. Sản phẩm có khả năng hòa tan tốt trong nước. Sản phẩm được ứng
dụng nhiều trong câc ngănh công nghệ thực phẩm, trong y học vă trong nông nghiệp [53].
Ngoăi ra, hemicellulase được ứng dụng nhiều trong xử lý phế liệu rau quả (núm quả, lõi quả, rau,...). Vì hemicellulose trong rau quả chủ yếu lă pentose, hemicellulase sẽ thủy phđn pentose tạo thănh những phđn tử đường có khối lượng thấp hơn, giúp cơ thể sinh vật hấp thụ tốt hơn [32].
Hiện nay, hemicellulase còn được ứng dụng trong sản xuất dầu dừa tinh khiết trong điều kiện pH = 7, nhiệt độ = 500C, thời gian 6ngăy với cơ chất lă cơm dừa vă phôi dừa[26].
Trong công nghệ sản xuất bia, nếu dùng nguồn nguyín liệu tinh bột khâc thay thế malt với tỷ lệ cao sẽ bổ sung thím enzyme hemicellulase nhằm đường hoâ câc tinh bột
Hemicellulase được ứng dụng để sơ chế thức ăn, phđn hủy câc hợp chất phức tạp tạo thănh câc hợp chất đơn giản dễ tiíu hoâ[32].
1.7. TỔNG QUAN VỀ SỮA BÒ TƯƠI
Sữa lă một trong những sản phẩm thực phẩm có giâ trị dinh dưỡng cao nhất. Trong sữa có đầy đủ tất cả câc chất dinh dưỡng cần thiết vă dễ được cơ thể hấp thụ. Ngoăi câc thănh phần chính lă protein, lactoza, lipit, muối khoâng còn có tất cả câc loại vitamin chủ yếu, câc enzym, câc nguyín tố vi lượng không thể thay thế.
Protein của sữa rất đặc biệt, có chứa nhiều vă hăi hòa câc axitamin cần thiết. Hăng ngăy mỗi người chỉ cần dùng 100g protein sữa đê có thể thỏa mên hoăn toăn nhu cầu về axit amin. Cơ thể người sử dụng protein sữa để tạo thănh hemoglobin dễ dăng hơn bất cứ protein của thực phẩm năo khâc. Độ tiíu hóa của protein sữa 96 – 98%.
Lipit của sữa giữ vai trò quan trọng trong dinh dưỡng. Khâc với câc loại mỡ động vật vă thực vật khâc, mỡ sữa chứa nhiều nhóm axit bĩo khâc nhau, chứa nhiều vitamin vă có độ tiíu hóa cao do có nhiệt độ nóng chảy thấp vă chất bĩo ở dưới dạng câc cầu mỡ có kích thước nhỏ.
Giâ trị dinh dưỡng của đường sữa không thua kĩm sacaroza.
Hăm lượng muối canxi vă phospho trong sữa cao, giúp cho quâ trình tạo thănh xương, câc hoạt động của nêo. Hai nguyín tố năy ở dạng dễ hấp thụ, đồng thời lại ở tỷ lệ rất hăi hoă. Cơ thể có thể hấp thụ được hoăn toăn. Đối với trẻ em, canxi của sữa lă nguồn canxi không thể thay thế.
Sữa lă nguồn cung cấp tất cả câc vitamin
Trong số câc thức ăn tự nhiín của con người không có sản phẩm năo mă hỗn hợp câc chất cần thiết lại được phối hợp một câch có hiệu quả như sữa[34].
Chất bĩo sữa được coi lă thănh phần quan trọng. Về mặt dinh dưỡng, chất bĩo có độ sinh năng lượng cao, có chứa câc vitamin hòa tan trong chất bĩo (A,D,E). Đối với câc sản phẩm sữa lín men, chất bĩo ảnh hưởng tới mùi vị, trạng thâi của sản phẩm. Có tới 98 - 99% chất bĩo của sữa lă câc triglyxerit, 1-2% còn lại lă phospholipit, cholesterol, caroten, vitamin A, D, E vă K.
Trong sữa có 18 axit bĩo. Mỗi glyxerit có thể kết hợp với ba phđn tử axit bĩo mă ba axit bĩo năy có thể cùng loại hoặc khâc loại. Vì vậy số glyxerit khâc nhau lă vô cùng lớn.
Chất bĩo của sữa bao gồm câc triglyxerit, diglyxerit, axit bĩo, sterol, carotenoit, vitamin A, D, E, K, vă một số chất khâc.
Khi để yín sữa, một lớp vâng sữa sẽ được tạo thănh trín bề mặt. Dưới kính hiển vi người ta nhận thấy trong vâng sữa có rất nhiều thể hình cầu với kích thước
khâc nhau, nổi tự do trong sữa. Mỗi thể cầu mỡ được bao bọc bằng một măng mỏng[29, 30].
Bảng 1.1:Thănh phần hóa học trung bình của 1 lít sữa bò I. Thănh phần tạo hình hoặc cung cấp năng lượng
- Nước - Chất bĩo - Lactoza - Chất chứa nitơ - Chất chứa muối 900-910g 35-45g 47-52g 33-36g 9-9,1g
II. Câc chất xúc tâc sinh học (không định lượng được hoặc ở dạng vết Câc sắc tố - enzyme – vitamin
III. Câc loại khí hòa tan: Khí cacbonic, oxy, nitơ (4-5% thể tích của sữa ra khỏi vú)
Từ bảng 1.1 cho thấy, chất bĩo trong sữa bò có hăm lượng khâ cao, gần 50% so với tổng hăm lượng chất khô. Đđy lă nguồn chất bĩo cung cấp năng lượng cao, câc vitamin cần thiết cho cơ thể vă một số câc acid bĩo không no có hoạt tính sinh học nếu chất bĩo được bảo quản tốt. Ngược lại, chất bĩo sẽ xảy ra câc biến đổi do quâ trình oxy hóa tạo nín câc hợp chất gđy mău, mùi lăm hư hỏng sản phẩm vă những hợp chất đó có thể gđy ngộ độc đối với cơ thể con người.
Bảng 1.2: Câc axit bĩo chủ yếu trong sữa[23].
Câc axit bĩo Số nguyín tử cacbon Điểm nhiệt độ nóng chảy Câc axit bĩo no
Butiric Caproic Caprilic Capric 4 6 8 10 -8 -2 16 31 Lauric Miristic Palmitic Stearic 12 14 16 18 44 54 63 70
Câc axit bĩo không no
Oleic Linoleic Linolenic 18:1 18:2 18:3 +14 -11 -5
Câc axit bĩo chiếm 98-99% tổng chất bĩo của sữa. Chất bĩo của sữa khâc với mỡ của câc động vật khâc lă chứa nhiều axit bĩo no, có khối lượng phđn tử thấp
1.8. TỔNG QUAN VỀ OXY HÓA CHẤT BĨO
Chất bĩo được cấu tạo từ câc acid bĩo chưa no dễ dăng bị oxy hóa dưới tâc dụng của oxy không khí, nhiệt độ, ânh sâng, chất xúc tâc kim loại như Cu, Fe, Zn,... lăm cho chất bĩo biến đổi nhiều. Mức độ biến đổi chất bĩo phụ thuộc nhiều yếu tố
như O2, nhiệt độ, ânh sâng vă hăm lượng kim loại nặng, enzyme lipoxidaza ,...nhưng quan trọng hơn cả lă số lượng acid bĩo chưa no có trong chất bĩo.
Khi chất bĩo bị oxy hóa, đầu tiín sẽ tạo ra câc hợp chất peroxit, hydroperoxit. Câc hợp chất năy không bền vă có tính hoạt động mạnh nín nhanh phđn hủy tạo thănh aldehyd, keton, ketoacid lăm cho sản phẩm có mùi ôi khĩt vă bị biến mău, giảm giâ trị cảm quan cũng như giâ trị dinh dưỡng[24]
Hình 1.1. Sự biến đổi về giâ trị cảm quan của chất bĩo
Ở nhiệt độ phòng, oxy không khí tâc dụng chủ yếu văo câc acid bĩo nhiều nối đôi. Nhưng khi nhiệt độ trín 500C thì không chỉ câc acid bĩo nhiều nối đôi bị oxy hóa, mă ngay cả acid bĩo một nối đôi cũng bị oxy hóa mạnh. Đđy lă cơ sở để tâc giả luận văn chọn khảo sât sự biến đổi của peroxit trong sữa bò trong điều kiện nhiệt độ phòng[31].
Giảm giâ trị
dinh dưỡng
Hư hỏng về mùi, vị, mău sắc vă giâ trị dinh dưỡng hoặc gđy độc hại
Chất bĩo
Oxy hoâ
Mất mău Aldehyd, alcol axit, xeton Gốc tự do Peroxyt
Chỉ số peroxit lă số gam iôt được giải phóng ra bởi peroxit có trong 100g mẫu. Trong không khí, câc axit bĩo có trong chất bĩo, đặc biệt lă câc axit bĩo không no dễ dăng bị oxi hóa một phần vă tạo thănh peroxit, gđy nín hiện tượng mỡ bị ôi.
Việc xâc định chỉ số peroxit dựa văo phản ứng sau:
R1 – CH = CH – R2 + KI + 2CH3COOH R1 – CH – CH – R2
+ 2CH3COOK + H2O + I2
Lượng iôt giải phóng ra được chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3
2 Na2S2O3 + I2 2 NaI + Na2S4O6
Chỉ số peroxyt biểu thị mức độ oxy hóa của chất bĩo. Chỉ số peroxyt căng
cao chất bĩo căng kĩm chất lượng vă chỉ số peroxyt tăng theo thời gian bảo quản[25].
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÍN CỨU
Chitin, chitosan lă vật liệu để sản xuất COS được sản xuất từ vỏ tôm sú theo quy trình sản xuất của Trần Thị Luyến, nơi lấy mẫu tại Trung tđm Chế biến Trường Đại học Nha Trang với câc chỉ tiíu chất lượng sau:
Chitosan có câc chỉ tiíu chất lượng như sau:
- Mău sắc: trắng ngă. - Trạng thâi: mềm mại.
- Hăm lượng chất không tan: 1,6% - Độ nhớt: 14,380E..
- Độ ẩm: 10%.
- Nitơ tổng quât:8,07% - Độ deacetyl hóa: 76,25%. - Hăm lượng tro: 0,023%
Chitin có câc chỉ tiíu chất lượng như sau:
- Mău sắc: trắng ngă.
- Độ ẩm:12%
- Hăm lượng protein: Đm tính
- Hăm lượng khoâng: 0,1%
Hình 2.2: Vật liệu chitin dạng bột
Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của Mỹ, nơi lấy mẫu tại công ty hóa chất Công Thănh - Quận 10 Thănh phố Hồ Chí Minh.
Enzyme có câc đặc điểm sau:
- Dạng bột.
- Mău trắng.
- Tan trong nước.
Hình 2.3: Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ Aspergillus niger
2.2. PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
2.2.1. Phương phâp phđn tích
- Xâc định hoạt độ enzyme hemicellulase. [22]
Nguyín tắc: Hoạt tính của enzyme hemicellulase được xâc định dựa trín phương phâp định lượng sản phẩm D – glucosamin của quâ trình phđn giải chitosan
- Xâc định chỉ số peroxyd bằng phương phâp chuẩn độ. [25]
Nguyín tắc: của phương phâp lă gốc peroxyd trong thực phẩm sẽ khử iod (I-) trong kali iodua thănh iod tự do (I2). Chuẩn độ iod tự do bằng dung dịch natri thiosunfat chuẩn.
- Xâc định tổng số vi sinh vật hiếu khí. [33]
Nguyín tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trín môi trường thạch dinh dưỡng (NA) từ một lượng mẫu xâc định dựa trín cơ sở xem mỗi khuẩn lạc lă sinh khối phât triển
từ một tế băo hiện diện trong mẫu vă được biểu thị dưới dạng số đơn vị hình thănh khuẩn lạc (CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.
- Xâc định Coliforms. [33]
Nguyín tắc: Đếm số khuẩn lạc đặc trưng mọc trín môi trường thạch VRB từ một lượng mẫu xâc định dựa trín cơ sở coi mỗi khuẩn lạc được hình thănh từ một tế băo vi sinh vật.
- Xâc định Escherichia coli[33]
Nguyín tắc: Tính số lượng tế băo theo phương phâp pha loêng tới hạn MPN (số lượng tế bằ có xâc suất lớn nhất trong một đơn vị thể tích của dịch huyền phù).
- Xâc định Staphylococcus aureus.[33]
Nguyín tắc: S.aureus được xâc định trín cơ sở câc đặc điểm tăng trưởng vă phản ứng đông huyết tương của câc dòng thuần từ câc khuẩn lạc đặc trưng trín môi trường phđn lập.
- Đânh giâ cảm quan theo phương phâp cho điểm TCVN 3215-79. [28],[33]
- Xâc định hăm lượng chất không tan[2].
Nguyín lý: Hòa tan COS văo trong nước sau một thời gian nhất định tiến hănh lọc dung dịch, sau đó cđn giấy lọc vă bê không tan còn lại.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm 2.2.2.1. Quy trình dự kiến 2.2.2.1. Quy trình dự kiến
Quy trình dự kiến thủy phđn chitin, chitosan bằng enzyme hemicellulase như sau:
Chitin được lăm mềm bằng câch tâc dụng với NaOH loêng, sau đó tiếp tục tâc dụng với HCl loêng vă hòa tan chitosan bằng câch tâc dụng với acid acetic loêng. Sau đó đưa chitin, chitosan thủy phđn bằng enzyme hemicellulase, trong công
đoạn thủy phđn kiểm soât câc thông số: Nồng độ enzyme, nồng độ chitin, chitosan,