Sau khi đưa ra được các thông số, điều kiện chiết thích hợp cho quy trình chiết lutein ester từ hoa CVT, tiến hành thử nghiệm chiết xuất lutein ester với quy mô phòng thí nghiệm. Định lượng lutein tổng số chiết được để xác định hiệu suất chiết của quy trình.
2.2.5. Tinh chế và đánh giá chất lƣợng sản phẩm
Dịch chiết lutein ester sau đó được cô đuổi dung môi để thu sản phẩm lutein ester thô (dầu nhựa lutein) và thu hồi dung môi.
Sản phẩm thô còn chứa nhiều tạp chất, do đó để tạo ra sản phẩm có khả năng ứng dụng làm chất màu thực phẩm hay phụ gia thức ăn chăn nuôi, cần tiến hành tinh chế. Để thực hiện điều này, chúng tôi áp dụng quy trình tinh chế lutein ester của Phillip (1997) [23]. Theo quy trình này, hòa tan sản phẩm thô trong một lượng tối thiểu isopropanol được đun nóng đến 75o C sao cho không tan được nữa. Lọc dung dịch nóng qua phểu lọc hút chân không để loại bỏ tạp chất không tan. Dịch lọc được để nguội ở 15oC qua đêm để kết tinh lutein ester. Lọc hút chân không để thu tinh thể lutein ester. Lặp lại quá trình tinh chế một lần nữa. Tinh thể lutein ester thu được đem sấy chân không ở 50o C rồi đuổi bằng dòng khí N2 để loại bỏ dư lượng dung môi còn sót lại.
Đánh giá chất lượng sản phẩm lutein ester theo quy định của Bộ Y tế về chất màu thực phẩm carotenoid (Phụ lục 23. QCVN 4-10 : 2010/BYT) thông qua xác định các chỉ tiêu: cảm quan; độ tan; quang phổ UV-Vis; phản ứng màu; % carotenoid tổng số (Phụ lục3).
2.2.6. Nghiên cứu phƣơng pháp bảo quản dịch chiết lutein ester
Sản phẩm lutein ester có thể bị phân hủy bởi tác động của các yếu tố bên ngoài (nhiệt độ, ánh sáng, không khí), làm giảm cường độ và đặc tính màu sắc của sản phẩm. Vì vậy, cần nghiên cứu độ bền màu của lutein ester trong các
điều kiện bảo quản khác nhau nhằm đưa ra phương pháp bảo quản thích hợp cũng như điều kiện ứng dụng cho sản phẩm.
Hòa tan khoảng 0,01 g sản phẩm lutein trong 25 ml dung môi hexan. - Hút 10 ml dung dịch thu được cho vào bình định mức 250 ml rồi pha loãng và định mức bằng hexan (ký hiệu dung dịch: KBHT)
- Cũng làm tương tự như vậy nhưng pha loãng và định mức bằng hexan có chứa 0,1% BHT (ký hiệu dung dịch: BHT).
Đo quang để xác định nồng độ ban đầu của lutein ester trong các dung dịch trên.
Cho các dung dịch trên lần lượt vào các lọ nhỏ đựng mẫu có nắp vặn rồi bảo quản ở các điều kiện khác nhau như sau (xem hình 2.3):
a) Dung dịch không có BHT:
- Ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng tự nhiên (ký hiệu mẫu: KBHT-TS) - Ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối (ký hiệu mẫu: KBHT-TT)
- Bảo quản lạnh ở 4o C, trong tối (ký hiệu mẫu: KBHT-4)
b) Dung dịch có BHT:
Cũng bảo quản trong các điều kiện như trên và được ký hiệu tương ứng là: BHT-TS; BHT-TT và BHT-4
Cứ sau 1 tuần, lấy các mẫu ra (mỗi loại mẫu lấy 2 lọ) đem đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 445 nm (dùng hexan làm dung dịch so sánh) và xác định % lutein còn lại theo công thức:
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ bền màu của dịch chiết lutein ester
Tiến hành đánh giá độ bền màu của dịch chiết lutein ester trong các điều kiện bảo quản nói trên. Từ đó, xác định phương pháp thích hợp cho việc bảo quản và điều kiện sử dụng chất màu lutein este thu được.
2.2.7. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu và vẽ đồ thị hai chiều bằng phần mềm MS Excel 2003.
Dung dịch lutein ester
Bảo quản ở nhiệt độ phòng Bảo quản lạnh
(40 C), trong tối
Đo quang - Quan sát
1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (tuần):
Đánh giá độ bền màu
PHẦN 3.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Một số thành phần hóa học của hoa cúc vạn thọ
Kết quả xác định hàm lượng chất khô (bảng PL4.9) và hàm lượng lutein tổng số (bảng PL4.8) của nguyên liệu bột hoa cúc vạn thọ được liệt kê trong bảng 3.1 sau đây:
Bảng 3.1. Một vài thành hóa phần hóa học cơ bản của hoa cúc vạn thọ
Thành phần Hàm lƣợng
Chất khô (%) 88,6
Lutein tổng số, mg/kg TL tươi 7.308 Lutein tổng số, mg/kg TL khô 8.247
Từ kết quả bảng 3.1, ta thấy:
- Nguyên liệu CVT chúng tôi sử dụng thu được từ cánh hoa CVT tươi đã qua công đoạn sấy khô (ở 70oC đến vừa khô giòn) và được bảo quản hơn 1 năm ở 4oC. Tuy vậy, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng lutein ester trong nguyên liệu vẫn còn khá cao, có thể dùng làm nguồn nguyên liệu tốt để chiết xuất lutein. Như vậy, việc sấy khô hoa cúc vạn thọ và bảo quản ở dạng bột khô vẫn là giải pháp thuận tiện, giúp chủ động được nguồn nguyên liệu trong sản xuất.
- Hàm lượng chất khô của hoa cúc vạn thọ khoảng 88,6%, ứng với độ ẩm nguyên liệu là 11,4%. Với độ ẩm này các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc) vẫn có thể phát triển được nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng trong môi trường ẩm. Do đó, để bảo quản trong thời gian dài, sau khi sấy xong nên đựng nguyên liệu trong bao bì hút chân không hay có chất chống mốc.
3.2. Xây dựng quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ
3.2.1. Chọn dung môi chiết
Kết quả thu được khi tiến hành chiết lutein ester từ hoa CVT bằng phương pháp ngâm chiết (Bảng PL4.1 và hình 3.1) cho thấy:
- Khi tăng nồng độ hexan trong dung môi lên từ 0‒60% thì hiệu suất chiết lutein ester tăng lên. Điều này được giải thích bởi sự giảm dần độ phân cực của dung môi khi tăng tỷ lệ hexan, do đó tăng hiệu quả hòa tan và chiết xuất chất màu. Nhưng sau đó, tiếp tục tăng nồng độ hexan (80‒100%) thì hiệu suất chiết tăng không đáng kể, vì ở mức nồng độ hexan 60% thì khả năng chiết xuất lutein ester gần như hoàn toàn. Do đó, mặc dù nồng độ hexane có tăng lên nhưng lượng lutein còn lại trong nguyên liệu rất ít dẫn đến hiệu suất chiết lutein ester về sau không cao.
- Với tỷ lệ ethanol:hexane 40:60 thì hiệu suất chiết lutein ester lớn nhất. Do đó, dung dịch ethanol:hexane với tỷ lệ 40:60 (v/v) được chọn làm dung môi chiết.
Ảnh hƣởng của dung môi đến hiệu suất chiết lutein ester 13.01 37.50 57.86 74.88 78.00 80.00 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100/0 80/20 60/40 40/60 20/80 0/100 Ethanol / Hexane (v/v) H iệ u su ất c hi ết (% )
3.2.2. Chọn tỷ lệ dung môi:nguyên liệu
Biểu đồ (hình 3.2) và bảng PL 4.2 trình bày kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi:nguyên liệu đến hiệu suất chiết lutein ester từ nguyên liệu bột hoa CVT sấy khô, cho thấy tỷ lệ dung môi:nguyên liệu tăng nhưng hiệu suất chiết lutein ester tăng không đáng kể.
- Khi tỷ lệ dung môi:nguyên liệu này nhỏ hơn 12:1 (v/w), hiệu suất chiết tăng lên khi tăng tỷ lệ dung môi:nguyên liệu. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi:nguyên liệu thì hiệu suất chiết gần như không thay đổi. Điều này có thể giải thích như sau: Với tỷ lệ dung môi:nguyên liệu nhỏ hơn 12:1 (v/w), lượng dung môi chưa đủ ngập hết nguyên liệu, do đó, hiệu suất chiết khá thấp (chỉ khoảng gần 40%). Khi tỷ lệ này đạt đến ngưỡng giá trị trên, toàn bộ khối nguyên liệu ngập hết trong dung môi nên hiệu suất chiết tăng đáng kể.
- Với tỷ lệ dung môi:nguyên liệu từ 12:1 (v/w) trở lên, toàn bộ khối nguyên liệu được tiếp xúc hoàn toàn với dung môi, hàm lượng lutein ester gần như tách hoàn toàn ra khỏi nguyên nên dù tỷ lệ tăng nhưng hiệu suất gần như là không thay đổi.
Mặc dù tỷ lệ 12:1 cho hiệu suất chiết tương đối cao trong thời gian ngắn nhưng hiệu suất tăng không đáng kể so với chi phí dung môi (Bảng
PL4.10), điều này ảnh hưởng trực tiếp đến mục đích kinh tế. Do đó, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu thích hợp nhất được chọn là 10:1 (v/w)
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi:nguyên liệu đến hiệu suất chiết lutein ester
3.2.3. Chọn thời gian chiết và số lần chiết
3.2.3.1. Xác định thời gian ngâm chiết
Qua đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất chiết lutein ester vào thời gian ngâm chiết (hình 3.3 và bảng PL4.4) ta thấy:
Khi tăng thời gian chiết từ 1–3 ngày thì hiệu suất chiết tăng mạnh (từ 55,79‒70,86%). Nhưng với thời gian chiết dài hơn, hiệu suất chiết lại giảm Sự giảm hiệu suất chiết trong trường hợp này có thể giải thích bởi sự tác động của yếu tố nhiệt độ, và sự oxy hóa làm mất màu và giảm hàm lượng lutein. Với thời gian ngâm chiết là 3 ngày, hàm lượng lutein thu được là cao nhất. Do đó, thời gian ngâm chiết được chọn là 3 ngày.
Chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
56 .1 0 59 .0 5 66 .2 7 66 .9 3 67 .0 9 49.84 58.80 66.54 76.87 109.53 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 8/1 10/1 12/1 14/1 20/1
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
H iệ u su ất c hi ết lu te in (% )
Hiệu suất chiết lutein Chi phí dung môi
Chọn thời gian ngâm chiết 55.79 64.82 70.86 67.35 67.25 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 1 2 3 4 5
Thời gian ngâm chiết (ngày)
H iệ u s uấ t c hi ết L ut ei n (% )
Hình 3.3. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào thời gian ngâm chiết
3.2.3.2. Xác định số lần ngâm chiết
Kết quả khảo sát sự thay đổi hiệu suất chiết theo số lần ngâm chiết (hình 3.4 và bảng PL4.3) cho thấy:
Khi tăng số lần chiết từ 1 đến 3 lần thì hiệu suất chiết tăng lên (66,27‒76,47%), nhưng sau 4 lần chiết hiệu suất tăng rất ít.
Nguyên nhân: Sau 3 lần chiết hàm lượng lutein còn lại trong nguyên liệu rất ít, do đó, gradient nồng độ giữa bề mặt phân cách pha rắn (nguyên liệu) với dung môi rất nhỏ, dẫn đến tốc độ chiết không đáng kể. Như vậy, để giảm chi phí sản xuất ta chọn số lần chiết là 3 lần.
Hình 3.4. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào số lần ngâm chiết
Tổng hợp toàn bộ quá trình nghiên cứu cho thấy, điều kiện thích hợp để chiết lutein ester từ hoa cúc như sau:
- Tỷ lệ thành phần dung môi chiết ethanol:hexane = 40:60 (v/v); - Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 10:1 (v/w);
- Thời gian ngâm chiết: 3 ngày/lần chiết - Số lần chiết: 3 lần
- Điều kiện ngâm chiết: ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng tự nhiên.
3.3. Hoàn thiện quy trình chiết sản xuất chất màu lutein ester từ hoa cúc vạn thọ - Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lƣợng sản phẩm vạn thọ - Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lƣợng sản phẩm
3.3.1. Hoàn thiện quy trình chiết sản xuất chất màu lutein ester từ hoa cúc vạn thọ cúc vạn thọ Chọn số lần ngâm chiết 66.27 72.05 76.47 78.28 78.83 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 1 2 3 4 5 Số lần ngâm chiết (lần) H iệ u su ất c hi ết lu te in (% )
Từ những khảo sát trên , có thể đề xuất quy trình sản xuất chất màu lutein ester từ hoa CVT như sau (hình 3.5):
Thuyết minh quy trình
- Nguyên liệu
Sử dụng nguyên liệu là bột hoa cúc vạn khô (thu được bằng cách sất cánh hoa tươi ở 700C cho đến khi khô giòn, rồi nghiền thành bột mịn). Nguyên liệu được bảo quản trong bao bì kín, hút chân không, trong mát. - Ngâm chiết
Cân chính xác lượng nguyên liệu (G kg) cho vào bồn ngâm chiết có nắp đậy kín để hạn chế sự bay hơi của dung môi. Thêm vào đó một thể tích hỗn hợp ethanol: hexane 40/60 v/v (cứ 4 lít ethanol trộn với 6 lít hexane) với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 10/1 v/w (cứ 1 kg nguyên liệu thêm vào đó 10 lít dung môi). Đậy kín hệ thống, để yên ở nhiệt độ phòng.
Cứ sau 3 ngày chiết rút dịch chiết một lần, thêm dung môi mới vào. Lặp lại như vậy 3 lần. Tất cả dịch chiết được gom lại vào một bồn chứa.
- Cô đuổi dung môi
Dịch chiết sau đó được hút vào bình chứa dung môi của hệ thống cô chân không. Tiến hành cô dịch chiết dưới áp suất thấp sao cho nhiệt độ sôi không quá 40oC, tránh ánh sáng tự nhiên.
Sau khi kết thúc quá trình cô dặc chân không, thu được dầu nhựa lutein (lutein ester thô) trong bình cô quay, Dung môi tách ra được đem chưng cất để thu ethanol và hexane tái sử dụng cho công đoạn ngâm chiết các mẻ nguyên liệu tiếp theo.
- Tinh chế
Dầu nhựa lutein cô đặc được tinh chế bằng cách hòa tan trong một thể tích tối thiểu isopropanol đã được đun nóng ở 75oC để hòa tan lutein ester. Lọc lấy dung dịch qua phễu lọc hút chân không để loại bỏ những tạp chất
không tan. Dịch lọc sau đó được làm lạnh đến 15oC, để qua đêm trong tủ mát để kết tinh lutein ester. Hỗn hợp lại được lọc qua phễu lọc hút chân không một lần nữa để thu tinh thể lutein ester nằm trên phễu lọc. Dịch lọc được cô chân không để thu hồi isopropanol tái sử dụng. Lặp lại quá trình tinh chế vừa rồi một lần nữa với tinh thể lutein ester.
- Sấy chân không
Sản phẩm lutein ester tinh thể thu được sau khi tinh chế được đem sấy chân không ở 50oC trong 3 h rồi đuổi dung môi còn sót lại bằng dòng khí N2. Sản phẩm thu được là bột màu lutein ester
Tất cả các thao tác trên nên thực hiện trong bóng tối.
Tất cả các dung môi và isopropanol đã thu hồi sẽ được lọc qua Na2SO4
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình sản xuất chất màu lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Bột màu lutein ester Thải isopropanol Sấy chân không Lutein ester tinh
chế Tinh chế Ngâm chiết
Bột hoa cúc vạn thọ
- Dung môi etanol- hexan 40:60 (v/v) + BHT 0,1% (w/v)
- Dung môi/ nguyên liệu 10:1 (v/w)
- Thời gian ngâm: 3 ngày/lần chiết. - Số lần chiết: 3 lần
Cô đuổi dung môi
Chưng cất Dung môi
Lọc
Dầu nhựa lutein
3.3.2. Kết quả thử nghiệm quy trình - Đánh giá chất lƣợng sản phẩm
Tiến hành thử nghiệm quy trình với 200 g bột hoa CVT khô (tiến hành 3 lần), thu được kết quả như sau:
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm quy trình sản xuất lutein ester Mẫu Lượng
mẫu (g)
Hiệu suất thu nhận lutein ester (%)
Lượng dầu nhựa lutein ester (g) Lượng sản phẩm lutein ester (g) 1 200 70,49 13,19 4,46 2 200 66,62 12,15 4,10 3 200 69,34 13,12 4,39 T.Bình 200 68,82 12,82 4,32
Kết quả sản xuất thực nghiệm ở bảng 3.2 cho thấy:
Sử dụng hệ dung môi ethanol:hexane cho hiệu suất chiết lutein ester trung bình gần 70% với lượng sản phẩm lutein ester tinh chế là 4,32 g/ 200g bột hoa khô, ứng với 21,6 g sản phẩm/kg bột hoa khô. Hiệu suất này hơi thấp hơn kết quả thu được khi tiến hành chiết với các lượng mẫu nhỏ trong quá trình khảo sát (khoảng 76%) do sự hao hụt chất màu trong quá trình lọc, chiết (bám dính trên các dụng cụ chứa) tuy nhiên lượng tinh thể lutein ester thu được lại cho kết quả cao hơn so với hàm lượng lutein ester thu được 21g/kg bột hoa khô trong nghiên cứu của Philip T. (1977).
Kết quả phân tích % Carotenoid trong sản phẩm lutein tinh thể (bảng
PL4.7) cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm thu được không cao: 39,76% carotenoid tổng số, thấp hơn so với nghiên cứu 51% của Philip T. (1977). Nếu xem toàn bộ lượng carotenoid này là lutein và giả thiết lutein ester trong mẫu tồn tại dưới dạng lutein dipalmitat thì có thể tính được hàm lượng lutein ester có trong sản phẩm chất màu nhận được là 72,34%. Mặt khác, thực nghiệm
cho thấy sản phẩm thu được không hẳn ở dạng bột khô mà hơi dẻo, sệt và có màu cam hơi sẫm. Điều này chứng tỏ sản phẩm còn một số tạp chất khó loại bỏ được trong quá trình tinh chế.
Sự khác nhau về độ tinh khiết giữa sản phẩm chúng tôi thu được và của Philip T. (1997) có lẽ xuất phát từ nguyên nhân là do Philip đã dùng hoa cúc vạn thọ đã qua ủ xi-lô để phá vỡ thành tế bào sắc tố chứa cellulose, pectin….