Phương pháp chiết xuất là bao gồm việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách chiết. Một phương pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể được hoạch định một khi đã biết rõ thành phần của các chất cần li trích trong cây ra. Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy, không thể có một phương pháp chiết xuất chung áp dụng cho tất cả hợp chất thiên nhiên.
Phương pháp cổ điển chiết xuất một hợp chất thiên nhiên là dùng một dãy dung môi bắt đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh để li trích, phân đoạn các hợp chất ra khỏi hợp chất thiên nhiên. Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn li trích. [36]
1.4.4. Các phƣơng pháp chiết xuất
Chiết gián đoạn:
Theo phương pháp này ta ngâm nguyên liệu vào dung môi. Sau một thời gian nhất định, khi giữa dung môi và nguyên liệu đạt nồng độ chất cần thiết ở mức độ cân bằng, tiến hành đổ dung môi cũ ra, thay dung môi mới vào. Cứ như thế cho đến khi chiết hết chất cần chiết. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, không tốn máy móc, thiết bị cũng như chi phí
năng lượng. Nhược điểm là tốn công, tốn thời gian cũng như tốn dung môi chiết nên không kinh tế, không phù hợp với quy mô sản xuất lớn.
Chiết bán liên tục:
Nguyên lý của phương pháp này là dùng nhiều thiết bị chiết gián đoạn bố trí thành một hệ thống liên hợp tuần hoàn, nhằm mục đích giảm thời gian chiết, ít tốn công hơn, tiết kiệm được nhiều dung môi hơn. Đối với phương pháp này, quá trình chiết thực hiện theo nguyên tắc dung môi đi từ nơi có nồng độ chất chiết cao đến nồng độ chất chiết thấp.
Chiết liên tục:
Nguyên lý là ngâm dung môi trong dòng chuyển động cùng chiều hay ngược chiều của dung môi. Ưu điểm của phương pháp này là cho hiệu quả kinh tế cao, thích hợp cho sản xuất công suất lớn, áp dụng cho quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, nhược điểm là thiết bị khá phức tạp, chi phí đầu tư lớn.[36]
1.4.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết xuất
- Chênh lệch nồng độ chất cần chiết ở trong nguyên liệu và dung môi; - Hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu;
- Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết; - Dung môi chiết [34]
1.4.6. Vài kỹ thuật chiết hiện đại dùng để chiết xuất chất màu tự nhiên
Chiết nhờ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction)
Nguyên liệu được trộn với dung môi thích hợp rồi chiết bằng siêu âm. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, từ đó giúp dung môi xâm nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với chất cần chiết và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết. [9], [22]
Đây là phương pháp chiết được quan tâm nhiều nhất hiện nay trong lĩnh vực chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu tự nhiên, nhằm ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm. Phương pháp này cho phép tự động hóa quá trình chiết và hạn chế việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại. Dung môi chiết là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn. Ở trạng thái này, chất lỏng có những tính chất đặc biệt như có tính chịu nén cao, khuếch tán nhanh, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp,… Do đó, nó có khả năng khuếch tán mạnh vào nền nguyên liệu tốt hơn nhiều so với các dung môi thông thường, vì thế làm tăng hiệu suất chiết lên nhiều lần. Trong phương pháp này, thường dùng CO2 trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết (đôi khi trộn với vài % dung môi phân cực nào đó như etanol, metanol, 2-propanol để làm tăng khả năng hòa tan carotenoit của CO2), do đó, nó cho phép chiết nhanh, chọn lọc, không làm oxy hóa carotenoit và an toàn trong vận hành.[19]
Chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent Extraction) hay
chiết dƣới áp suất cao (PFE: Pressurized Fluid Extraction)
Đây cũng là một phương pháp chiết mới, cho phép chiết rất nhanh, tự động hóa, hiệu quả và tiết kiệm dung môi. Nguyên tắc của nó tương tự như phương pháp chiết Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao (nhưng vẫn dưới điểm tới hạn của dung môi sử dụng). Trong phương pháp ASE, nguyên liệu cần chiết được xay nhỏ, làm khô (thường là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell). Ống chiết này được đặt trong lò duy trì ở nhiệt độ thích hợp (có thể điều chỉnh từ 40–200oC). Dung môi được bơm vào ống chiết và giữ ở áp suất 10‒ 20 MPa trong vài phút (static time), sau đó dịch chiết được đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume). Quá trình được lặp lại vài
lần. Cuối cùng, toàn bộ dịch chiết được đẩy ra bằng một dòng khí trơ N2.[10]
1.4.7. Tình hình nghiên cứu chiết xuất lutein ester trên thế giới
Việc ứng dụng lutein vào các ngành công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm phát triển mạnh mẽ. Kết quả khảo sát cho thấy, CVT châu Phi là nguồn nguyên liệu lutein lý tưởng cho việc thu nhận lutein: cánh hoa có hàm lượng lutein ester khá lớn (1,0–1,6% carotenoid tổng số tính theo trọng lượng khô), trong đó, khoảng 90% lượng carotenoid này là lutein và 5% là zeaxanthin. Trong dịch chiết lutein ester bằng dung môi [FAO(2004)], chiếm hơn 80% là carotenoid tổng số, trong đó lutein chiếm 70–78%, zeaxanthin (2–9%) và một số carotenoid khác, ngoài ra, còn tìm thấy chất sáp (14%) và acid béo (1%) trong oleoresin chưa qua chế biến [7].
Trong nghiên cứu Philip, T. (1977) đã nghiên cứu chiết xuất lutein ester từ bột hoa CVT sấy khô bằng ete dầu mỏ ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 1:3 (w/v). Dịch chiết được cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp ở 50oC để thu lutein oleoresin, sau đó, đem hòa tan trong isopropanol nóng ở 75oC rồi lọc bỏ tạp chất không tan. Dịch lọc được làm lạnh xuống 15o C hay thấp hơn. Lutein ester tách ra được lọc và làm khô dưới áp suất thấp ở 30o C để thu lutein ester tinh thể.[23]
Levy, L. W. (2001) đã cải tiến quy trình của philip T. (1977) để thu sản phẩm oleoresin có tỷ lệ trans-ester cao bằng cách bằng cách ngâm bột hoa CVT khô trong hexan (8 l/kg) ở nhiệt độ phòng. Tách lấy dịch chiết, cô đuổi dung môi để thu lutein ester thô. Sau đó, thêm isopropanol vào lutein ester thô ở nhiệt độ phòng để hòa tan cis-lutein ester và các tạp chất không thuộc nhóm xanthophyll. Sản phẩm sau đó được cô chân không để loại bỏ isopropanol. Kết quả thu được sản phẩm chứa 69% lutein ester trong đó tỷ lệ đồng phân trans:cis là 90:10.[20]
Bột hoa CVT cũng được sử dung làm nguyên liệu trong nghiên cứu của Kumar S.T.K.(2004). Tác giả đã dùng 2-propanone hoặc 2-butanone thay cho isopropanol trong công đoạn loại bỏ tạp chất và đồng phân cis-lutein ester có trong oleoresin. Như vậy, dư lượng dung môi có thể cô đuổi ở nhiệt độ phòng. Kết quả đã tăng tỷ lệ đồng phân trans:cis trong sản phẩm lên ít nhất 18:1. [18]
Ngoài ra, cũng xuất hiện nhiều hướng nghiên cứu hạn chế sự thủy phân lutein ester trong công đoạn chiết, giảm thời gian chiết và tăng hiệu suất chiết bằng cách dùng các kỹ thuật hiện đại như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, chiết bằng CO2 siêu tới hạn hay chiết với áp suất cao.
Theo nghiên cứu của Peter Amala Sujith, T.V. Hymavathi and P. Yasoda Devi (2010) sử dụng phương pháp chiết bằng CO2 siêu tới hạn với áp suất là 27,5 MPa, nhiệt độ là 60oC dịch chiết thu được từ bột hoa CVT chiếm từ 23‒ 40% hàm lượng lutein ester. [17]
Theo nhóm nghiên cứu của Trường Kỹ thuật Dầu khí và Hóa chất, Đại học Khoa học và Công nghệ Lan Châu, Trung Quốc (2010), thực hiên chiết lutein ester từ hoa CVT (Tagetes erecta) với dung môi hỗ trợ sóng siêu âm thu được hàm lượng lutein ester 17,17 mg/kg. [21]
Mặc dù các kỹ thật chiết hiện đại đã dươc áp dụng khá phổ biến trong quy mô phòng thí nghiệm ở các nước trên thế giới, tuy nhiên, việc áp dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất còn hạn chế, do chi phí đầu tư thiết bị cao, không kinh tế. Trong thực tế, lutein ester chủ yếu vẫn được chiết bằng phương pháp ngâm chiết của hoa CVT khô trong hexan. Chính vì vậy, trong đồ án tốt nghiệp này đã thực hiện chiết lutein ester từ bột hoa CVT (Tagetes erecta L.) bằng phương pháp ngâm chiết gián đoạn.
PHẦN 2.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu chính:
Trong nghiên cứu này, nguyên liệu dùng để chiết lutein là hoa CVT (Tagetes erecta L.) đã được sấy khô ở 70oC và nghiền thành bột mịn
Hóa chất:
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng trong đề tài
Hóa chất Độ tinh khiết Xuất xứ
Etanol ≥ 99,7% Trung Quốc Hexan ≥ 97% Na2SO4 khan ≥ 99% Isopropanol ≥ 99,7% BHT ≥ 99% Merck (Đức)
Nước cất 1 lần - Chưng cất tại phòng thí
nghiệm 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ: - Bình lắng gạn; - Ống nghiệm; - Bình tam giác 250 ml;
- Bình định mức 10ml, 25ml; 50ml, 100 ml - Cốc thủy tinh 500ml, 50ml, 100ml;
- Phễu lọc 8; - Ống nghiệm 18; - Pipet 1ml, 5ml; - Phễu lọc thủy tinh;
- Giấy lọc, giấy nhôm, bông hút nước; - Ống đong;
- Cốc đốt thủy tinh.
Thiết bị:
- Quang phổ kế Genesys 20 (THERMO, Mỹ ); - Quang phổ kế UV-VIS Carry 50 (VARIAN, Mỹ); - Tủ lạnh;
- Cân phân tích điện tử chính xác 10-4 g (SATORIUS, Mỹ); - Tủ sấy mẫu UNB 400 (Memmert, Đức);
- Máy cất nước 2 lần WSC/4D (Hamilton, Anh); - Hệ thống cất quay chân không gồm:
Máy cô quay chân không RV10 (IKA, Đức);
Bơm hút chân không N 026.3 AN 18 (KNF, Đức);
Bể làm lạnh tuần hoàn VS – 1902 WF (VISION, Hàn quốc).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định một số thành phần hóa học của cánh hoa cúc vạn thọ
a) Xác định hàm lượng chất khô: Sấy ở nhiệt độ 105–110oC đến khối lượng không đổi (Phụ lục 1)
b) Xác định hàm lượng lutein tổng số: Chiết hoàn toàn lutein ester bằng acetone, phân bố dịch chiết trong eter dầu mỏ, định mức và đo độ hấp thụ của dung dịch ở 445 nm (Phụ lục 2).
2.2.2. Quy trình dự kiến sản xuất lutein ester từ hoa cúc vạn thọ.
Trên cơ sở kết quả của một số nghiên cứu liên quan, chúng tôi đề xuất quy trình dự kiến sản xuất chất màu lutein từ cánh hoa CVT như hình 2.1
Giải thích quy trình - Nguyên liệu
Bột hoa khô thu nhận từ cánh hoa CVT tươi bằng cách sấy khô ở 70oC rồi nghiền thành bột. Bột hoa được bảo quản ở 4oC và bao bì kín, hút chân không
- Ngâm chiết
Ngâm chiết nhằm mục đích chiết xuất chất dầu nhựa oleoresin chứa chất lutein ester cần chiết ra khỏi bột hoa CVT bằng dung môi hữu cơ.
Tiến hành ngâm bột hoa CVT trong điều kiên kín khí theo phương pháp ngâm chiết với các điều kiện thích hợp (tỷ lệ dung môi ethanol:hexane (v/v); tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian ngâm; số lần chiết) ngâm ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng tự nhiên. Dung môi chiết được bổ sung 0,1% BHT (w/v) để ngăn sự oxy hóa và phân hủy lutein ester. Thu dịch chiết, làm khan bằng Na2SO4 .
- Làm khan
Thu dịch chiết qua phễu lọc bằng bông y tế có Na2SO4 ở dạng rắn để hút làm khan nước trong dịch chiết, đồng thời giúp loại phần cánh hoa còn sót lại trong dịch chiết tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đuổi dung môi tiếp theo.
- Cô đuổi dung môi
Cô đuổi dung môi nhằm mục đích thu hồi chất dầu nhựa lutein oleoresin ở dạng cô đặc đồng thời thu hồi dung môi, đem chưng cất và tái sử dụng.
Tiến hành làm khô dung môi ở điều kiện áp suất thấp 400–600 mbar, nhiệt độ không quá 40oC, tránh ánh sáng tự nhiên để hạn chế khả năng oxy hóa và phân hủy lutein ester.
- Tinh chế
Tinh chế lutein ester để thu sản phẩm ở dạng tinh thể.
Sau khi cô đuổi hết dung môi thu được lutein ester thô. Tinh chế lutein ester bằng cách hòa tan trong isopropanol ở 75oC nhằm mục đích hòa tan lutein ester. Tiếp theo, lọc dung dịch qua phễu lọc hút chân không để lọc bỏ những tạp chất không tan. Dịch lọc sau đó được làm lạnh xuống 15oC, để qua đêm trong tủ mát để tạo điều kiện kết tinh các lutein ester. Sau đó, lọc qua phễu lọc hút chân không một lần nữa để thu sản phẩm lutein ester tinh thể.
- Sấy chân không
Thực hiện sấy chân không sản phẩm kết tinh ở 50oC để thu lutein ester ở dạng tinh thể khô. Đuổi dung môi còn sót lại bằng dòng khí N2 (30 phút)
Sau khi thu hồi hỗn hợp dung môi hexan-ethanol, cần tiến hành chưng cất hỗn hợp này để tách riêng từng dung môi được thu hồi và tiếp tục dùng cho các mẻ sau.
Dung dịch chứa isopropanol sau khi lọc lấy tinh thể cũng được cô chân không và chưng cất để thu hồi isopropanol tinh khiết và tiếp tục sử dụng cho lần sau.
Tất cả các thao tác trên nên thực hiện trong bóng tối.
Tất cả các dung môi và isopropanol đã thu hồi sẽ được lọc qua Na2SO4 dạng rắn để loại nước trong dung môi sau thu hồi.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Lutein ester tinh thể Ngâm chiết Bột hoa cúc vạn thọ (G gam) - Dung môi?
- Dung môi:Nguyên liệu? - Thời gian ngâm?. - Số lần chiết? Chưng cất Dung môi Lọc Thải isopropanol
Cô đuổi dung môi
Dầu nhựa lutein
Bột màu lutein ester
Sấy chân không
2.2.3. Xác định điều kiện thích hợp chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ
Cân chính xác khoảng G g nguyên liệu cho vào bình chứa.
Để đạt được hiệu suất chiết cao, cần chọn được điều kiện tốt nhất để chiết lutein bằng cách tiến hành các lô thí nghiệm sau:
a) Chọn dung môi chiết (Lô TN1):
Việc lựa chọn dung môi để chiết trước hết cần dựa vào khả năng hòa tan các sắc tố, tức dựa trên sự tương thích giữa tính phân cực của dung môi và của chất cần chiết. Lutein trong hoa CVT tồn tại ở dạng ester, có tính phân cực thấp. Do vậy, các dung môi có tính phân cực thấp sẽ hòa tan tốt sắc tố này. Trong một số nghiên cứu trên thế giới về tách chiết chất màu lutein ester. Các dung môi thường được sử dụng là ete dầu mỏ (Philip, T., 1977), hexan (Levy L. W., 2001), hay acetone, ethanol hoặc hỗn hợp dung môi hexane- acetone (Serena Lim Sue Lynn, 2003) [19], [ 22], [25], trong đó thông dụng nhất là dùng hexane, Tuy nhiên, hexane là dung môi khá đắt tiền nên để tiết kiệm chi phí dung môi, chúng tôi thử nghiệm thay thế hexane bằng hỗn hợp hexane-ethanol. Do vậy, cần khảo sát hệ dung môi hexane-ethanol thích hợp để đạt hiệu suất chiết cao nhất. Thí nghiệm tiến hành như sau:
Cố định tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10:1(v/w). Tiến hành chiết 1 lần bằng phương pháp ngâm chiết (24 h, ở nhiệt độ phòng, trong tối).
Dung môi chiết sử dụng là dung dịch ethanol-hexane, trong đó tỷ lệ hexane trong hỗn hợp dung môi (X1) thay đổi lần lượt từ 0 –100% (v/v):
X1 = 0; 20; 40; 60; 80; 100 % (v/v).
Dịch chiết sau đó được chiết sang dung môi hexan, pha loãng đến thể tích thích hợp bằng hexan rồi đo quang ở 445 nm để xác định hiệu suất chiết lutein (%H) theo công thức:
%H = lượng lutein chiết đượclượng lutein tổng số ×100%
Từ đó, chọn tỷ lệ hexan thích hợp. Lưu ý:
Lutein kém bền nhiệt và ánh sáng nên tất cả các thí nghiệm ngâm chiết đều tiến hành chiết ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối.
b) Chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (Lô TN2):
Dùng dung môi chiết thích hợp đã chọn. Tiến hành chiết 1 lần bằng phương pháp ngâm chiết (24 h, ở nhiệt độ phòng, trong tối), trong đó tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (X2) thay đổi như sau:
X2 = 8:1; 10:1; 12:1; 14:1; 20:1 (v/w)
Gạn lấy dịch chiết, tiến hành đo quang để xác định hiệu suất chiết. Từ đó, chọn tỷ lệ dung môi:nguyên liệu thích hợp.