IV. CÁC CHỈ TIÊU VÀ YÊU CẦU KỸ THUẬT CHO SẢN PHẨM
1. Chỉ tiêu về nguyên liệu đầu vào:
3.5 Xác định hàm lượng tro không tan trong axit clohydric (HCl)
Nguyên tắc
Hòa tan tro trong axit clohydric 10 %, sau đó nung và xác định phần cịn lại.
Tiến hành
Tiến hành nung mẫu theo TCVN 4070 - 85, sau đó dùng 30 ml axit clohydric 10 % hịa tan tro chuyển tồn bộ dung dịch vào cốc thủy tinh rồi đun trên nồi cách thủy 30 phút. Lọc dung dịch bằng giấy lọc định lượng khơng tro, rửa chất khơng tan bằng nước cất nóng cho đến khi hết ion Cl-(thử ion Cl- bằng dung dịch bạc nitrat 1 %).
Chuyển giấy lọc có chất khơng tan trong axit clohydric 10 % vào chén nung (chén nung đã biết khối lượng). Đem than hóa hồn tồn trên bếp điện và tiếp tục nung, cân đến khối lượng không đổi.
3.6.1 Xác định Asen bằng phương pháp so màu với thuốc thử bạc dietyldithiocacbamat (phương pháp trọng tài)
Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cất asin (AsH3 ) ra khỏi hỗn hợp rồi phản ứng với thuốc thử bạc dietyldithiocacbamat trong pyridin cho một sản phẩm có màu đỏ nâu và được đo màu ở bước sóng 520nm.
Tiến hành
Đặt vào ống nối của bộ cất AsH3 4 – 5 hạt KOH, sau đó phủ đầy bơng tẩm axetat chì, trong ống hấp thụ lấy 10ml dung dịch hấp thụ bạc dietyldithiocacbamat trong piridin. Lấy vào 6 bình phản ứng của dụng cụ cất AsH3 lần lượt các dung dịch sau đây: 0,0; 0,1; 0,2; 0,5 và 1,0 ml dung dịch chuẩn 10 mg As/ml, trong bình thứ 6 lấy 10ml dung dịch mẫu phân tích, thêm dung dịch H2SO4 1: 10 cho đến thể tích 25 ml, thêm tiếp 15 ml HCl đậm đặc 5ml KI, 0,5 ml dung dịch SnCl2. Lắc đều, để yên trong chỗ tối 10 phút. Sau đó thêm vào bình 5g kẽm hạt, đậy nút thật nhanh và kín, lắp ống hấp thụ vào cuối ống dẫn mao quản, cho đầu mao quản gần sát xuống đáy. Tiếp tục quá trình cất AsH3 60 phút. Nếu trời rét có thể đun nóng bình phản ứng lên khoảng 30 – 350C.
Đo mật độ quang của dung dịch hấp thụ tại bước sóng 520 nm, dùng cuvet có bề dầy 1 cm với dung dịch so sánh bạc dietyldithiocacbamat trong piridin.
Từ các kết quả dựng đường chuẩn sự phụ thuộc giữa khối lượng As có trong dung dịch và mật độ quang, từ đó xác định khối lượng As trong mẫu phân tích.
3.6.2 Xác định As bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Nguyên tắc
Asen được cất ra dưới dạng AsH3 nhờ chất khử NaBH 4 trong bình hidrua hóa, dẫn hơi AsH 3 vào buồng ngun tử hóa nhờ một dịng khí nitơ và đo phổ hấp thụ bằng đèn catot rỗng As.
Tiến hành
Các thao tác với máy AAS có đèn catốt rỗng As theo chỉ dẫn sử dụng của hãng sản xuất.
Chuẩn bị dung dịch: lấy vào 6 bình phản ứng có dung tích cỡ 50 – 100 ml lần lượt 2 ml dung dịch MgCl2 0,1M; trong các bình từ 1 đến 5 lần lượt thêm bằng micropipet 0,0; 100; 200; 400 và 600 ml dung dịch chuẩn, trong bình thứ 6 thêm 10ml dung dịch mẫu phân tích, thêm 0,5 ml dung dịch KI 10% vào mỗi bình, lắc đều và để yên 2 – 3 phút. Nối bình hidrua hóa với máy AAS và điều chỉnh các thơng số theo chỉ dẫn của nhà sản xuất máy.
Thêm 4ml dung dịch NaBH 4 4% vào ngăn đựng thuốc thử của bình hidrua hóa, đậy nút, thao tác nhẹ nhàng và nhanh tay, đồng thời mở van khí
nitơ, lắc nhẹ, nghiêng bình phản ứng để trộn dung dịch thuốc thử và dung dịch chuẩn (cũng như dung dịch mẫu phân tích), chờ máy ghi tín hiệu đến khi bút trở về đường nền thì kết thúc, mở nút, tráng bình phản ứng và tiếp tục với các dung dịch mẫu khác (chuẩn và phân tích).
Từ các kết quả nhận được, lập đồ thị phục thuộc khối lượng (mg) As trong dung dịch chuẩn và số chỉ của máy, từ đó suy ra khối lượng (As) trong mẫu phân tích.
Khi có nghi ngờ cần thực hiện với mẫu trắng.
3.7 Xác định hàm lượng chì [20]
4.7.1 Xác định hàm lượng chì theo phương pháp von - ampe hồ tan (phương pháp trọng tài)
Nguyên tắc
Điện phân làm giầu Pb lên bề mặt điện cực hoạt động (giọt Hg cố định hay màng Hg trên nền điện cực than) tại một điện thế âm xác định, trong những điều kiện lặp lại, sau đó hồ tan lượng Pb đã được làm giàu bằng cách phân cực anốt và ghi đỉnh hoà tan tương ứng.
Tiến hành
- Phân tích theo đường chuẩn. + Chuẩn bị các dung dịch. + Đo von-ampe hồ tan
- Phân tích theo phương pháp thêm tiêu chuẩn
4.7.2 Xác định hàm lượng chì bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sau khi chiết
Nguyên tắc
Chì trong mẫu sữa sau khi vơ cơ hố theo tiêu chuẩn TCVN 4662 - 1994 được chiết bằng amoni 1-pyrrolidinecarbodithiolate (APDC) với dung môi butylaxetat (BuOAc) hoặc metylizobutylxêton (MIBX) rồi phun dịch hữu cơ này vào ngọn lửa đèn C2H2 - không khí, đo cường độ hấp thụ bằng đèn catot rỗng Pb tại vạch phổ Pb-217 nm (vạch 1) hoặc Pb-283,3 nm (vạch 2).
Tiến hành
- Chiết các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu phân tích. + Chiết bằng dung mơi MIBX
+ Chiết bằng butylaxetat (BuOAc) - Đo phổ hấp thụ.
3.8 Xác định hàm lượng cadimi [21]
Phần mẫu thử được làm khô và sau đó tro hóa ở 450 °C với nhiệt độ tăng dần. Bổ sung dung dịch axit clohydric 6 M và cho bay hơi đến khơ. Phần cặn được hịa tan trong dung dịch axit nitric 0,1 M, các chất phân tích được xác định bằng đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa dùng lị graphit.
Tiến hành
Xử lý sơ bộ Sấy
Tro hóa
Tro hóa trong lị nung cài đặt chương trình
Tro hóa trong lị múp có bộ ổn nhiệt, sau khi sấy và tro hóa sơ bộ Đo phổ hấp hu nguyên tử
Kỹ thuật đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa
Kỹ thuật đo phổ hấp thụ nguyên tử dùng lò graphit
3.9 Xác định hàm lượng thủy ngân [22]
Nguyên tắc
Thủy ngân được tách ra khỏi phần mẫu thử đã phân hủy dưới dạng hơi thủy ngân bằng phương pháp hóa hơi lạnh, sau đó lượng thủy ngân được xác định bằng đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa. Hàm lượng thủy ngân được xác định theo phương pháp đường chuẩn.
Tiến hành
Phân hủy mẫu
Cân khoảng 5,0 phần mẫu thử cho vào bình phân hủy (4.5), thêm 25 ml axit sulfuric 9 M (3.11), 20 ml axit nitric 7 M (3.9), 1ml dung dịch natri molipdat 2 % (3.12) và 5 mảnh đến 6 mảnh chống trào (4.7). Lắp bộ sinh hàn (tuần hoàn nước) (4.3) và đun nhẹ trong khoảng 1 giờ. Ngắt nhiệt và để yên trong vòng 15 phút. Thêm 20 ml hỗn hợp dung dịch axit nitric (3.9) và axit pecloric (3.13) theo tỷ lệ 1:1 qua bộ sinh hàn (4.3).
Tắt nước tuần hoàn qua bộ sinh hàn và đun sơi mạnh đến khi xuất hiện khói trắng trong bình. Tiếp tục đun trong 10 phút.
Để nguội, thêm cẩn thận 10 ml nước qua bộ sinh hàn trong khi vẫn khuấy dung dịch trong bình. Đun sơi tiếp dung dịch trong 10 phút. Tắt bếp và rửa bộ sinh hàn 3 lần, mỗi lần bằng 15 ml nước. Để nguội đến nhiệt độ phịng.
Tiến hành đo
Chuyển tồn bộ mẫu đã phân hủy vào bình định mức 100 ml và pha lỗng bằng nước đến vạch. Chuyển 25,0 ml phần mẫu thử vào bình phân hủy (4.5) khác. Dùng dung dịch pha loãng (3.2) để điều chỉnh thể tích đến 100 ml. Chỉnh tốc độ tại đầu ra của bơm đến khoảng 2 lít khí/phút bằng bơm màng (4.2). Lắp thiết bị như ở Hình 1, trừ ống nối khí. Chỉnh máy quang phổ về
“0” khi máy bơm đang hoạt động, thêm 20 ml dung dịch khử (3.1) để hịa tan phần mẫu thử. Lắp ngay ống nối khí và thổi khí vào trong khoảng 3 phút. (Điều chỉnh thời gian thổi khí để thu được bộ hấp thụ tối đa). Ghi lại giá trị độ hấp thụ A, xả áp ở phần ngoài của bơm và mở lỗ thống trên bình lọc để hệ thống cân bằng.
Dựng đường chuẩn
Chuẩn bị mẫu trắng và dựng đường chuẩn bằng cách cho 0 ; 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 và 1,0 thủy ngân vào một dãy các bình phân hủy. Thêm vào mỗi bình 100 ml dung dịch pha loãng (3.2). Cuối cùng, thêm dung dịch khử (3.1) và thực hiện các thao tác như đối với mẫu thử.
Dựng đường chuẩn. Nếu hàm lượng thủy ngân nằm ngồi đường chuẩn thì lặp lại phép xác định với phần dung dịch thử nhỏ hơn để đưa lượng thủy ngân vào phạm vi của đường chuẩn.
3.10 Xác định aflatoxin tổng số [23]
Nguyên tắc
Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần xác định dịch lọc, được làm sạch qua cột silicagel. Để bay hơi dịch phản hấp phụ và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen-axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định aflatoxin của mẫu thử trên sắc ký lớp mỏng và so sánh Rf, màu sắc và mật độ huỳnh quang với dung dịch aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang.
Tiến hành
- Sắc ký lớp mỏng một chiều: + Chuẩn bị:
+ Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin + Định lượng: Bằng mắt
Bằng máy đo mật độ huỳnh quang - Sắc ký lớp mỏng hai chiều
+ Chuẩn bị + Khai triển + Sắc ký bổ sung
+ Định lượng: Bằng mắt
Bằng máy đo mật độ huỳnh quang
3.11 Xác định tổng số bào tử nấm men, nấm mốc [24]
Nguyên tắc
Chuẩn bị các đĩa khác theo cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng một phần mười từ huyền phù ban đầu.
Ni hiếu khí các đĩa chứa mơi trường thạch để đếm vi khuẩn ở 30 °C trong 3 ngày.
Ni hiếu khí các đĩa chứa mơi trường thạch để đếm nấm men và nấm mốc ở 25 °C trong 3 ngày , 4 ngày, hoặc 5 ngày
Tính số vi khuẩn từ số khuẩn lạc mọc trên các đĩa mơi trường thạch ni cấy được
Tính số nấm men và/hoặc mốc từ số khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch nuôi cấy đã được chọn
Tiến hành
Phần mẫu thử
Chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu Chuẩn bị các dung dịch pha lỗng Cấy
Ni ấm Biểu thị
3.12 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí [25]
Ngun tắc
Chuẩn bị hai đĩa rót, để rót mơi trường ni cấy quy định và cấy vào đó một lượng mẫu thử xác định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc dùng một lượng huyền phù ban đầu xác định nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Chuẩn bị các cặp đĩa khác, trong cùng một điều kiện thử, cấy các dịch pha loãng thập phân từ mẫu thử hoặc từ huyền phù ban đầu.
Ni hiếu khí các đĩa ở 300C trong 72 h.
Tính số lượng vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam mẫu từ số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa được chọn
Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng (Xem TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan tới sản phẩm.)
Cấy và nuôi ấm
Lấy hai đĩa Petri vô trùng dùng pipet vô trùng cho vào đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác. Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-1) của mẫu thử nếu sản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-2) của huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Lặp lại trình tự này với các dịch pha lỗng tiếp theo và dùng pipet mới vơ trùng đối với mỗi dịch pha lỗng thập phân.
Rót khoảng 15 ml môi trường đếm đĩa ở 450C ± 0,5 0C vào mỗi đĩa Petri. Thời gian từ khi chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc dịch pha loãng 10-
1nếu sản phẩm là chất lỏng) đến khi rót mơi trường vào các đĩa không được vượt quá 15 phút.
Trộn cẩn thận mẫu cấy với môi trường và để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa Petri trên mặt bàn ở chỗ mát.
Sau khi các đĩa đã đông đặc hoàn toàn, và chỉ khi nghi ngờ sản phẩm được xét nghiệm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thể mọc lan trên bề mặt của mơi trường, rót khoảng 4 ml mơi trường thạch nước ở 450C ± 0,5 0C lên bề mặt môi trường đã cấy mẫu. Để cho đông đặc như mô tả ở trên.
Thao tác này nếu có tiến hành thì phải ghi lại trong báo cáo thử nghiệm. Lật ngược các đĩa đã cấy mẫu và đưa vào nuôi ở tủ ấm ở 300C trong 72 h ± 3 h.
Đếm khuẩn lạc:Sau thời gian ủ ấm theo quy định, dùng thiết bị đếm khuẩn lạc tiến hành đếm hoặc các khuẩn lạc trong mỗi đĩa chứa không quá 300 khuẩn lạc.
3.13 Xác định Staphylococcus aureus [26]
Nguyên tắc
Cấy lên bề mặt của môi trường cấy đặc chọn lọc, sử dụng hai đĩa, dùng một lượng mẫu thử quy định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lượng huyền phù ban đầu quy định nếu sản phẩm ở dạng khác.
Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc củahuyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng.
Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35 °C hoặc 37 °C và kiểm tra sau 24h và 48h.
Tính số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một mililit, hoặc trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/ hoặc khơng điển hình trên các đĩa ở các bộ phận pha lỗng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.
Tiến hành
Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng (Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm liên quan.)
Dùng pipet vô trùng chuyển vào hai đĩa thạch mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu (độ pha loãng 101) nếu sản phẩm ở dạng khác. Lặp lại trình tự này đối với độ pha lỗng 10-2 và các độ pha loãng thập phân tiếp theo nếu cần.
Đối với sản phẩm nhất định, tốt nhất để đếm staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase với số lượng thấp, thì các giới hạn phát hiện có thể tăng lên 10 lần bằng cách cấy 1,0 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 1,0 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt của một đĩa thạnh lớn (140 mm) hoặc lên bề mặt của ba đĩa thạch nhỏ (90 mm) . Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị mẫu kép bằng cách dùng hai đĩa to hoặc sáu đĩa nhỏ.Sử dụng dụng cụ dàn mẫu (6.9) dàn chất cấy cẩn thận càng nhanh càng tốt, lên mặt đĩa thạch, cố gắng không chạm vào mép đĩa. Để các đĩa có nắp đậy cho đến khơ trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng thử nghiệm.
Ủ
Lật ngược các đĩa đã được chuẩn bị theo 9.2.3 và ủ chúng trong 24 h ± 2 h sau đó ủ lại thêm 24 h ± 2 h trong tủ ấm (6.2) ở 35 °C hoặc 37 °C .
Chuẩn bị các đĩa và diễn giải
Sau khi ủ 24 h ± 2 h, đánh dấu vị trí của các khuẩn lạc điển hình có mặt dưới đáy của các đĩa.
Ủ lại tất cả các đĩa ở nhiệt độ 35 °C hoặc 37 °C 4) thêm 24 h ± 2 h, và đánh dấu các khuẩn lạc điển hình mới. Đồng thời cũng đánh dấu cả các khuẩn lạc khơng điển hình có mặt
Chỉ lấy các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc với 150 khuẩn lạc điển hình và/ hoặc khơng điển hình ở hai dung dịch kế tiếp nhau để định lượng. Một trong các đĩa phải chứa ít nhất 15 khuẩn lạc. Chọn để khẳng định lượng A đã có (thường 5 khuẩn lạc điển hình, hoặc 5 khuẩn lạc khơng điển hình nếu chỉ có khuẩn lạc khơng điển hình, hoặc 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc khơng điển hình nếu cả hai loại đều có mặt ở mỗi đĩa).
CHÚ THÍCH 1: Các khuẩn lạc điển hình có màu đen hoặc màu xám, bóng và lồi (có đường kính từ 1 mm đến 1,5 mm sau khi ủ trong 24 h, và từ 1,5 mm đến 2,5 mm sau khi ủ 48 h) và được bao quanh bởi một vùng trong rõ rệt, cũng có thể là mờ từng phần. Sau khi ủ trong ít nhất 24 h, có thể xuất hiện một vịng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc.
CHÚ THÍCH 2: Các khuẩn lạc khơng điển hình cùng kích cỡ như khuẩn lạc điển hình và có thể có một trong các trạng thái sau: