IV. CÁC CHỈ TIÊU VÀ YÊU CẦU KỸ THUẬT CHO SẢN PHẨM
1. Chỉ tiêu về nguyên liệu đầu vào:
3.10 Xác định aflatoxin tổng số
Nguyên tắc
Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần xác định dịch lọc, được làm sạch qua cột silicagel. Để bay hơi dịch phản hấp phụ và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen-axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định aflatoxin của mẫu thử trên sắc ký lớp mỏng và so sánh Rf, màu sắc và mật độ huỳnh quang với dung dịch aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang.
Tiến hành
- Sắc ký lớp mỏng một chiều: + Chuẩn bị:
+ Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin + Định lượng: Bằng mắt
Bằng máy đo mật độ huỳnh quang - Sắc ký lớp mỏng hai chiều
+ Chuẩn bị + Khai triển + Sắc ký bổ sung
+ Định lượng: Bằng mắt
Bằng máy đo mật độ huỳnh quang
3.11 Xác định tổng số bào tử nấm men, nấm mốc [24]
Nguyên tắc
Chuẩn bị các đĩa khác theo cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng một phần mười từ huyền phù ban đầu.
Ni hiếu khí các đĩa chứa mơi trường thạch để đếm vi khuẩn ở 30 °C trong 3 ngày.
Ni hiếu khí các đĩa chứa mơi trường thạch để đếm nấm men và nấm mốc ở 25 °C trong 3 ngày , 4 ngày, hoặc 5 ngày
Tính số vi khuẩn từ số khuẩn lạc mọc trên các đĩa mơi trường thạch ni cấy được
Tính số nấm men và/hoặc mốc từ số khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch nuôi cấy đã được chọn
Tiến hành
Phần mẫu thử
Chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu Chuẩn bị các dung dịch pha lỗng Cấy
Ni ấm Biểu thị
3.12 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí [25]
Ngun tắc
Chuẩn bị hai đĩa rót, để rót mơi trường ni cấy quy định và cấy vào đó một lượng mẫu thử xác định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc dùng một lượng huyền phù ban đầu xác định nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Chuẩn bị các cặp đĩa khác, trong cùng một điều kiện thử, cấy các dịch pha loãng thập phân từ mẫu thử hoặc từ huyền phù ban đầu.
Ni hiếu khí các đĩa ở 300C trong 72 h.
Tính số lượng vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam mẫu từ số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa được chọn
Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng (Xem TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan tới sản phẩm.)
Cấy và nuôi ấm
Lấy hai đĩa Petri vô trùng dùng pipet vô trùng cho vào đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác. Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-1) của mẫu thử nếu sản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-2) của huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Lặp lại trình tự này với các dịch pha lỗng tiếp theo và dùng pipet mới vơ trùng đối với mỗi dịch pha lỗng thập phân.
Rót khoảng 15 ml môi trường đếm đĩa ở 450C ± 0,5 0C vào mỗi đĩa Petri. Thời gian từ khi chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc dịch pha loãng 10-
1nếu sản phẩm là chất lỏng) đến khi rót mơi trường vào các đĩa không được vượt quá 15 phút.
Trộn cẩn thận mẫu cấy với môi trường và để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa Petri trên mặt bàn ở chỗ mát.
Sau khi các đĩa đã đông đặc hoàn toàn, và chỉ khi nghi ngờ sản phẩm được xét nghiệm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thể mọc lan trên bề mặt của mơi trường, rót khoảng 4 ml mơi trường thạch nước ở 450C ± 0,5 0C lên bề mặt môi trường đã cấy mẫu. Để cho đông đặc như mô tả ở trên.
Thao tác này nếu có tiến hành thì phải ghi lại trong báo cáo thử nghiệm. Lật ngược các đĩa đã cấy mẫu và đưa vào nuôi ở tủ ấm ở 300C trong 72 h ± 3 h.
Đếm khuẩn lạc:Sau thời gian ủ ấm theo quy định, dùng thiết bị đếm khuẩn lạc tiến hành đếm hoặc các khuẩn lạc trong mỗi đĩa chứa không quá 300 khuẩn lạc.
3.13 Xác định Staphylococcus aureus [26]
Nguyên tắc
Cấy lên bề mặt của môi trường cấy đặc chọn lọc, sử dụng hai đĩa, dùng một lượng mẫu thử quy định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lượng huyền phù ban đầu quy định nếu sản phẩm ở dạng khác.
Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc củahuyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng.
Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35 °C hoặc 37 °C và kiểm tra sau 24h và 48h.
Tính số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một mililit, hoặc trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/ hoặc khơng điển hình trên các đĩa ở các bộ phận pha lỗng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.
Tiến hành
Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng (Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm liên quan.)
Dùng pipet vô trùng chuyển vào hai đĩa thạch mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu (độ pha loãng 101) nếu sản phẩm ở dạng khác. Lặp lại trình tự này đối với độ pha lỗng 10-2 và các độ pha loãng thập phân tiếp theo nếu cần.
Đối với sản phẩm nhất định, tốt nhất để đếm staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase với số lượng thấp, thì các giới hạn phát hiện có thể tăng lên 10 lần bằng cách cấy 1,0 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 1,0 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt của một đĩa thạnh lớn (140 mm) hoặc lên bề mặt của ba đĩa thạch nhỏ (90 mm) . Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị mẫu kép bằng cách dùng hai đĩa to hoặc sáu đĩa nhỏ.Sử dụng dụng cụ dàn mẫu (6.9) dàn chất cấy cẩn thận càng nhanh càng tốt, lên mặt đĩa thạch, cố gắng không chạm vào mép đĩa. Để các đĩa có nắp đậy cho đến khơ trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng thử nghiệm.
Ủ
Lật ngược các đĩa đã được chuẩn bị theo 9.2.3 và ủ chúng trong 24 h ± 2 h sau đó ủ lại thêm 24 h ± 2 h trong tủ ấm (6.2) ở 35 °C hoặc 37 °C .
Chuẩn bị các đĩa và diễn giải
Sau khi ủ 24 h ± 2 h, đánh dấu vị trí của các khuẩn lạc điển hình có mặt dưới đáy của các đĩa.
Ủ lại tất cả các đĩa ở nhiệt độ 35 °C hoặc 37 °C 4) thêm 24 h ± 2 h, và đánh dấu các khuẩn lạc điển hình mới. Đồng thời cũng đánh dấu cả các khuẩn lạc khơng điển hình có mặt
Chỉ lấy các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc với 150 khuẩn lạc điển hình và/ hoặc khơng điển hình ở hai dung dịch kế tiếp nhau để định lượng. Một trong các đĩa phải chứa ít nhất 15 khuẩn lạc. Chọn để khẳng định lượng A đã có (thường 5 khuẩn lạc điển hình, hoặc 5 khuẩn lạc khơng điển hình nếu chỉ có khuẩn lạc khơng điển hình, hoặc 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc khơng điển hình nếu cả hai loại đều có mặt ở mỗi đĩa).
CHÚ THÍCH 1: Các khuẩn lạc điển hình có màu đen hoặc màu xám, bóng và lồi (có đường kính từ 1 mm đến 1,5 mm sau khi ủ trong 24 h, và từ 1,5 mm đến 2,5 mm sau khi ủ 48 h) và được bao quanh bởi một vùng trong rõ rệt, cũng có thể là mờ từng phần. Sau khi ủ trong ít nhất 24 h, có thể xuất hiện một vịng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc.
CHÚ THÍCH 2: Các khuẩn lạc khơng điển hình cùng kích cỡ như khuẩn lạc điển hình và có thể có một trong các trạng thái sau:
Các khuẩn lạc đen bóng có hoặc khơng viền trắng hẹp; khơng có vùng trong hoặc hầu như khơng nhìn thấy và khơng có vịng trắng đục hoặc rất khó nhìn thấy
Các khuẩn lạc khơng điển hình được hình thành chủ yếu bởi các chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm bẩn trong các sản phẩm, ví dụ, các sản phẩm sữa, tơm và các bộ phận của vật nuôi. Chúng thường ít khi được hình thành bởi nhiễm các chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm bẩn trong các sản phẩm khác.
CHÚ THÍCH 3: Các khuẩn lạc khác là tất cả các khuẩn lạc cịn lại có khả năng có mặt trên các đĩa mà khơng cho thấy biểu hiện bên ngồi điển hình hoặc khơng điển hình như đã mơ tả trong Chú thích 1 và Chú thích 2, và được coi là hệ vi khuẩn nền.
Nếu dàn 1,0 ml chất cấy lên ba đĩa, thì xử lý các đĩa này giống nhau theo các quy trình đếm và khẳng định.
Để ước tính số lượng nhỏ staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase, thì giữ lại tất cả các đĩa có chứa chất khuẩn lạc điển hình và khơng điển hình. Chọn tất cả các khuẩn lạc để khẳng định nằm trong giới hạn đề ra ở trên.
Khẳng định (phép thử coagulase)
Từ mỗi khuẩn lạc đã chọn, dùng que cấy vô trùng lấy một phần và chuyển vào ống hoặc lọ đựng môi trường canh thanh não – tim
Ủ ở 35 °C hoặc 37 °C trong 24 h ± 2 h.
Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1 ml mỗi dịch cấy cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ (trừ khi nhà sản xuất quy định các lượng khác) đựng trong các ống hoặc lọ đựng dung dịch hồng cầu vô trùng và ủ ở nhiệt độ 35 °C hoặc 37 °C
5).
Nghiêng ống, kiểm tra sự kết dính của huyết tương sau khi ủ từ 4 h đến 6 h và nếu phép thử là âm tính, thì kiểm tra lại sau khi ủ 24 h, hoặc kiểm tra theo thời gian ủ được nhà sản xuất quy định.
Nếu thể tích kết dính chiếm hơn một nửa thể tích ban đầu của chất lỏng, thì phép thử coulase là dương tính.
Để kiểm tra âm tính, đối với mỗi mẻ huyết tương, thêm 0,1 ml môi trường canh thanh não-tim vô trùng vào một lượng huyết tương thỏ đã khuyến cáo và ủ nhưng không cấy. Phép thử hợp lệ khi kiểm tra huyết tương cho thấy khơng có dấu hiệu kết dính.
3.14 Xác định Escherichia Coli [27]
Nguyên tắc
Phương pháp phát hiện
Cấy một lượng qui định huyền phù ban đầu của mẫu thử vào môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc.
Ủ ống nghiệm ở 37 oC đến 48 giờ. Sau 24 giờ và 48 giờ kiểm tra ống về sự sinh khí.
Nếu thấy ống nghiệm mờ, đục, hoặc sinh khí thì cần cấy truyền sang ống nghiệm có chứa mơi trường lỏng chọn lọc (canh thang EC).
Ủ ống nghiệm thu được trong 4.1.3 ở 44 oC đến 48 giờ. Sau 24 giờ và 48 giờ, kiểm tra các ống về sự sinh khí.
Nếu ống nghiệm thu được trong 4.1.4 cho thấy sinh khí thì cần cấy truyền sang ống nghiệm có chứa nước pepton khơng chứa indol.
Ủ ống nghiệm thu được trong 4.1.5 ở 44 oC trong 48 giờ. Kiểm tra ống nghiệm về sự sinh indol do sự phân hủy của tryptophan trong pepton.
Các ống nghiệm cho thấy mờ đục, hoặc sinh khí trong mơi trường tăng sinh lỏng và khi được cấy truyền có sinh khí trong canh thang EC và sinh indol trong nước pepton ở 44 oC được coi là các ống có chứa E.coli giả định. Các kết quả được chỉ rõ là “có mặt” hoặc "khơng có mặt“ E.coli giả định trong x g hoặc x ml sản phẩm.
Phương pháp định lượng
Cấy một lượng qui định huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép.
Cấy một lượng qui định huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ đơn.
Sau đó, trong cùng điều kiện, cấy một lượng qui định của các dung dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm khác đựng môi trường nồng độ đơn
Ủ ấm các ống môi trường nồng độ đơn và nồng độ kép ở 37 oC đến 48 giờ. Sau 24 giờ đến 48 giờ kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí.
Từ mỗi ống mơi trường nồng độ kép cho thấy mờ, đục hoặc sinh khí, từ mỗi ống đựng mơi trường nồng độ đơn cho thấy sinh khí, được cấy truyền vào ống nghiệm đựng môi trường lỏng chọn lọc (canh thang EC).
Ủ các ống thu được ở 44 oC trong 48 giờ. Sau 24 giờ đến 48 giờ, kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí.
Mỗi ống nghiệm thu được trong cho thấy sinh khí được cấy truyền sang ống nghiệm chứa nước pepton không chứa indol.
Ủ các ống thu được trong ở 44 oC đến 48 giờ. Kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh indol do sự phân huỷ của tryptophan trong pepton.
Xác định số có xác suất lớn nhất của E.coli giả định theo bảng MPN ứng với số lượng ống đựng môi trường nồng độ đơn và nồng độ kép và sau khi cấy truyền có sinh khí trong môi trường (EC) và sinh indol trong nước pepton ở 44 oC.
Tiến hành
- Phương pháp phát hiện:
+ Ủ môi trường tăng sinh chọn lọc (canh thang lauryl sunfat) + Cấy và ủ môi trường chọn lọc (canh thang EC)
+ Cấy và ủ môi trường nước pepton + Kiểm tra về sự sinh indol
+ Diễn giải
- Phương pháp định lượng:
+ Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng + Cấy và ủ môi trường tăng sinh chọn lọc (canh thang lauryl sunfat) + Cấy truyền và ủ môi trường chọn lọc (canh thang EC)
+ Cấy và ủ môi trường nước pepton + Kiểm tra về sự sinh indol
+ Diễn giải
3.15 Xác định Clostridium perfringens [28]
Nguyên tắc
Các đĩa Petri được cấy một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Đối với các đĩa Petri khác, trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Rót mơi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính mơi trường này.
Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 37 °C trong 20 h ± 2 h. Định lượng các khuẩn lạc điển hình.
Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng
C.perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu.
Tiến hành:
- Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng - Cấy và ủ (kỹ thuật rót đĩa)
- Đếm và chọn các khuẩn lạc - Khẳng định sinh hoá
- Kỹ thuật khẳng định sử dụng mơi trường nitrat để thử tính di động và mơi trường lactoza-gelatin
- Giải thích kết quả
3.16 Xác định Salmonella [29]
Nguyên tắc
- Tiền tăng sinh trong môi trương lỏng không chọn lọc Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc
- Cấy lên đĩa thạch và nhận dạng