VÀ ỨNG DỤNG
Năm 1857, Corvisat tách được trypsin từ dịch tụy đây là protease tách được dưới dạng chế phẩm, nhưng chưa được tinh sạch. Năm 1861, Bruke tách được pepsin ở dịch dạ dày chó dưới dạng tương đối tinh khiết.
Năm 1862, Danivevski đã tách được trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ.
Năm 1970, Kerry T. Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết protease trung tính từ môi trường nuôi B.subtilis theo phương pháp bán rắn và nhận thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động, có pHopt từ 6,5-7,5, topt là 570C. Protease này bị ức chế bởi Cu2+,Ni2+, Hg2+, Pb2+, Cd2+, Fe2+ và khi có mặt của ion Ca2+ thì enzyme này có thể bền trong khoảng pH từ 5,5-10 [43].
Dong Ho Ahn, Hoon Kim và Pack My (1993) đã nghiên cứu về protease tách từ Bacillus megaterim ATCC 14945 và nhận thấy protease này có thể bị kết tủa bằng amonium sulphate, có pHopt 7,5, nhiệt độ tối thích 550C, protease này cần có ion Ca2+ và bị ức chế mạnh bởi EDTA [33].
Gonchar Am và Auslender VI (1996) đã tiến hành nghiên cứu cố định các protease của vi khuẩn B.subtilis trên 1,4 – polyalkylene oxid bằng phương pháp chiếu chùm tia electron và chỉ ra rằng các protease cố định bền với nhiệt hơn các protease dạng tự nhiên [39].
Theo P.M. Nielsen và cộng sự, (2001) có các phương pháp theo dõi độ thủy phân (DH) trong quá trình thủy phân protein, như: pH-stat, osmometry, soluble nitrogen content, và trinitro-benzen-sulfonic acid (TNBS). Nhưng các phương pháp này có những hạn chế nhất định.
Phương pháp pH-stat cần phải bổ sung kiềm (hay acid) nhằm giữ pH không đổi trong suốt quá trình thủy phân.
Phương pháp osmometry là dựa vào sự thay đổi của điểm đông đặc, dùng thiết bị cryoscope để đo sự tương quan để tính DH. Phương pháp này có hạn chế là không
19
dùng dung dịch có độ nhớt cao, dung dịch có nhiều chất tan như muối, chất bảo quản…
Phương pháp TNBS là dựa vào phản ứng giữa nhóm amin với trinitro-benzen- sulfonic acid. Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là nặng nhọc và không có kết quả nhanh đồng thời thuốc thử TNBS không ổn định, độc và có thể gây nổ.
Trong nghiên cứu này, P.M. Nielsen và cộng sự dùng phương pháp sử dụng thuốc thử o-phthaldialdehyde (OPA) so sánh với phương pháp TNBS trên cơ sở đo DH của dịch thủy phân protein đậu nành và Na-caseinate và đưa ra kết luận là: Phương pháp dùng thuốc thử OPA tỏ ra chính xác hơn phương pháp TNBS, tốn ít thời gian hơn. Đồng thời chỉ ra rằng phương pháp dùng thuốc thử OPA có thể dùng để xác định DH trong dịch thủy phân protein, trong thực phẩm cũng như trong thức ăn cho động vật. [47].
Năm 2001, F. Guerard và cộng sự đã nghiên cứu thủy phân bao tử cá ngừ bằng enzyme Alcalase tại nhiệt độ 500C, pH = 8. Sau đó dịch thu được sau 5,5 giờ thủy phân được đem làm đông khô. Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm này dùng làm chất bổ sung nitơ cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật có kết quả tốt như những pepton công nghiệp dùng nuôi cấy vi sinh vật. [36].
Peizhi Lian và cộng sự, (2001) đã nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp trực giao quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme Flavourzyme 1000 MG và Protamex. Nghiên cứu cho thấy hàm lượng acid amin tự do sau thủy phân đạt 24,8% so với 8,2% so với mẫu đối chứng. Sản phẩm thu được có kết quả tốt nhất ở 500C sau 6 giờ thủy phân.[48].
Năm 2003, Bjørn Liaset và cộng sự đã nghiên cứu thủy phân phế liệu (phần xương sau khi phi lê tách thịt) cá hồi bằng enzyme Protamex ở điều kiện nhiệt độ 550C, pH tự nhiên là 6,5, nồng độ enzyme là 11,1 AU/kg protein thô với tỷ lệ phế liệu/nước là 1,14. Sau 6 giờ thủy phân, kết quả thu được hỗn hợp thủy phân giàu các acid amin thiết yếu và acid béo [31].
Năm 2004, Suthasinee Nilsang và cộng sự ở trường đại học Mahidol – Thái Lan đã dùng 2 loại enzyme protease là Flavourzyme 1000L và Kojizyme 800L bổ
20
sung để thủy phân dịch thải từ qui trình cá ngừ đóng hộp để sản xuất dịch đạm. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu khi sử dụng Flavourzyme 1000L bổ sung vào thủy phân là ở nhiệt độ 450C, nồng độ enzyme là 50 LAPU/g protein (5%), nồng độ cơ chất 20% (w/w) ở tại pH tự nhiên của nguyên liệu (5,9-6,0), thời gian thủy phân 6 giờ thì DH đạt 62%. Đối với Kojizyme 800L, điều kiện tối ưu là ở nhiệt độ 500C, nồng độ enzyme là 40 LAPU/g protein (5%), nồng độ cơ chất 20% (w/w) ở tại pH tự nhiên của nguyên liệu (5,9-6,0), thời gian thủy phân 6 giờ thì DH đạt 68% [55].
Năm 2005, P. Z. Lian và cộng sự đã nghiên cứu thủy phân phế liệu mực tại nhiệt độ 550C, pH tự nhiên với hệ enzyme protease nội tại của bản thân nguyên liệu. Kết quả sau 30 phút thủy phân các phân tử vật chất có khối lượng lớn hơn 116,25 kDa biến mất và sau 2 giờ thủy phân khối lượng các phân tử trong dịch thủy phân nhỏ hơn 45 kDa. Độ thủy phân sau 2 giờ thủy phân tăng từ khoảng 10,17 đến 18,7%, hàm lượng acid min tự do tăng từ 16,99 đến 46,55gm/g. Đồng thời qua nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng dầu trong dịch thủy phân chiếm 1,78% bao gồm nhiều loại acid béo. Trong đó eicosapentaenic acid (EPA) và docosahexaenic acid (DHA) là 2 loại acids béo rất cần thiết cho sự phát triển của cá con chiếm lần lượt là 11,16%, 24,45% cao hơn nhiều so với dầu cá hồi (8,65% EPA và 10,67% DHA) [46].
Năm 2006, Tavakoli Omid và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất dầu và chất béo từ phế liệu mực. Quá trình thủy phân được tiến hành ở nhiệt độ 443 – 653 K (170 - 3800C). Kết quả cho thấy năng suất thu hồi dầu và chất béo đạt lớn nhất tại nhiệt độ 473 và 493 K (200 và 2200C). Sản phẩm thu được bao gồm các loại acid béo: omega- 3 polyunsaturated fatty acids, EPA, and DHA, oleic, palmitic…[57].
Theo phát minh của Lee Chong M, Lian Piezhi năm 2006 khi thử nghiệm sử
dụng sản phẩm phế liệu mực thủy phân dùng làm chất kích thích bắt mồi cho cá hồi (trout) con cho thấy sản phẩm phế liệu mực thủy phân sau 2 giờ có khả năng kích thích sự bắt mồi của cá hồi mạnh hơn sản phẩm phế liệu mực chưa thủy phân và sản phẩm phế liệu mực thủy phân sau 3 giờ. Cụ thể là sau 5 phút thử nghiệm, ở mẫu bổ sung sản phẩm phế liệu mực thủy phân sau 2 giờ có 21/25 cá đến bắt mồi cao hơn mẫu bổ sung sản phẩm phế liệu mực chưa thủy phân (10,5/25 cá) và mẫu bổ sung sản
21
phẩm phế liệu mực thủy phân sau 3 giờ (10/25 cá). Đồng thời trong phát minh này cũng cho thấy khi bổ sung sản phẩm phế liệu mực thủy phân vào thành phần thức ăn thì tỷ lệ sống của cá hồi (salmon) giống cao hơn mẫu đối chứng. Khi sử dụng 5% sản phẩm phế liệu mực thủy phân dùng phủ bên ngoài thức ăn, thử nghiệm trên 7 tuần trên cá hồi salmon, thấy hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và tỷ lệ tăng trọng ngày (DWR) là 0,96 và 2,81 so với mẫu đối chứng là 1,12 và 2,56 [44].
Tháng 8 năm 2009, Thomas Ho đã nghiên cứu dùng dịch thủy phân cá thu làm chất gây mùi dẫn dụ khả năng bắt mồi cho cá hồi trắng. Cá thu được xay nhỏ sau đó thủy phân với Alcalase 2,4 AU/g hoặc flavozyme 500L, nồng độ enzyme/protein là 3%, thời gian thủy phân 1 hay 4 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy các sản phẩm thủy phân sau 1 và 4 giờ có chứa hàm lượng peptid và các acid amin khác nhau. Mẫu thủy phân bằng Flavozyme 500L có hàm lượng acid amin tự do cao hơn mẫu dùng Alcalase 2,4 AU/g, Mẫu 4h thủy phân có hàm lượng acid amin tự do cao hơn mẫu 1h. Khi sử dụng dịch thủy phân cá thu bổ sung vào thức ăn ở tỷ lệ 2% dùng làm chất thì tỷ lệ tăng trưởng của cá tăng, hệ số chuyển đổi thức ăn giảm. Dịch thủy phân cá thu dùng làm chất gây mùi dẫn dụ cho cá hồi trắng trong nghiên cứu này được chứng minh là có hiệu quả [58].
Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng protease, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, ứng dụng … Một số công trình nghiên cứu về protease tại Việt Nam như:
Năm 1983 Phạm Thị Trân Châu công bố các nghiên cứu về protease
B.pumillus cho thấy từ môi trường nuôi cấy B.pumillus có thể thu được hai protease: một protease kiềm điển hình hoạt động ở pH 10,7 và một protease trung tính nhạy cảm với DFP gọi là serine- metalo- proteinase hoạt động ở pH 7,0. Mặt khác các nghiên cứu của tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease này trong chế biến cá đem lại hiệu quả kinh tế cao [9].
Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex G-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp ở 500C, 600C và pH thích hợp tương ứng là 8,5 và 7,5. Tác giả còn cho
22
thấy có thể sử dụng protease đầu tôm trong thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [14].
Đỗ Văn Ninh (2004) công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng cá và gan mực cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực là một hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ thích hợp từ 50 550C và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong thủy phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thủy phân ứng dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [19].
Vũ Ngọc Bội (2004) công bố các nghiên cứu về protease B.subtilis S5 cho thấy có thể dùng nước cất để thu nhận protease với hoạt tính cao từ canh trường nuôi
B.subtilis S5 theo phương pháp nuôi cấy bán rắn và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật bằng cách dùng ethanol để gây kết tủa. protease thu được có nhiệt độ thích hợp là 550C và pH thích hợp là 6,0. Protease có thể sử dụng rất tốt trong thủy phân cơ thịt cá tạp để sản xuất bột đạm thủy phân và thủy phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày [3].
Năm 2006, Phan Thị Thanh Phương đã nghiên cứu nuôi cấy B. subtilis trên môi trường pepton, sau đó dùng môi trường này ủ kỵ khí với bả cà phê trong 24 giờ. Bả cà phê thu được dùng phối trộn trong thành phần viên thức ăn nhằm kích thích bắt mồi nhanh cho cá kèo. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung vào thức ăn 1% dung dịch bã cà phê đã xử lý vi sinh đã kích thích cá ăn nhanh hơn, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn một cách tốt hơn [23].
Năm 2007, Phùng Huy Huấn và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng dung dịch giàu acid amin được thủy phân từ cá phế thải kết hợp với chất điều hoà sinh trưởng GA3 (gibberellic acid) để xử lý ra hoa sớm và đồng loạt, chống rụng trái non đăc biệt phục hồi ra hoa lại (nếu bị sương muối hoặc mưa). Kết quả nghiên cứu đối với cây điều đã cho thấy năng suất tăng 35,4% trên thí nghiệm diện hẹp và 34,8% trên thí nghiệm diện rộng so với đối chứng [13].
Năm 2008, Phan Thị Bích Trâm và cộng sự đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tạo đạm amin của quá trình tự phân giải trùn quế. Trùn quế được rửa sạch cho hết đất cát, nghiền nhuyễn bằng cối xay, phân tích thành phần nguyên
23
liệu ban đầu. Sau đó tiến hành quá trình tự phân giải với các yếu tố ảnh hưởng gồm pH, loại và lượng dung dịch bổ sung vào dịch trùn thủy phân, nhiệt độ và thời gian thủy phân. Kết quả thí nghiệm cho thấy, điều kiện tối ưu cho hệ protease trùn quế tự thủy phân ở nhiệt độ 550C và hoạt động tốt trong môi trường nước và pH =10. Hiệu suất thủy phân đạt cao nhất 46,2% tương ứng với hàm lượng protein trong dung dịch thủy phân đạt 9%, hoạt tính đặc hiệu của enzym ban đầu là 0,097U/mg protein và thời gian thủy phân là 24 giờ. Điện di trên gel SDS-Page sau 24 giờ cho kết quả, hầu hết các protein trùn quế có trọng lượng phân tử cao đều bị thủy phân và thành phần trong dịch thủy phân nhận được ngoài các acid amin là các polypeptid có trọng lượng phân tử dưới 25,0 kDa. Từ đó, đề tài kiến nghị, cần nghiên cứu chế độ sấy dịch thủy phân và phối trộn thêm nguyên liệu để thử nghiệm nuôi ấu trùng tôm hoặc cá con nhằm làm tăng giá trị của sản phẩm [26].
Năm 2008, Phạm Thị Đan Phượng và cộng sự đã nghiên cứu xử lý carotenoprotein thu hồi từ quá trình sản xuất chitin và dùng phối trộn vào thức ăn nuôi cá Chẽm. Kết quả thí nghiệm cho thấy bột carotenoprotein có thể sử dụng để thay thế bột cá trong việc chế biến thức ăn viên cho cá Chẽm, tuy sự có chấp nhận thấp hơn thức ăn công nghiệp theo thời gian nuôi [24].
Năm 2009, Nguyễn Minh Trí và cộng sự đã nghiên cứu ép tách protein từ đầu tôm thẻ (Penaeus vannamei) trong sản xuất chitin sau đó dùng dịch protein này cô đặc và bổ sung vào chượp trong sản xuất nước mắm. Kết quả thí nghiệm cho thấy khi bổ sung dịch thủy phân protein (khoảng 20% thể tích chượp) vào chượp sau 105 ngày, sau 1 tháng thu được nước mắm tương ứng với lượng protein bổ sung [28].
Năm 2009, Trang Sĩ Trung đã nghiên cứu đánh giá chất lượng sản phẩm và hiệu quả môi trường của qui trình sản xuất chitin cải tiến kết hợp xử lý enzyme và có kết luận: hổn hợp protein và astaxanthin thu được từ qui trình này có chất lượng cao, có thể ứng dụng chế biến thức ăn gia súc [29].
24
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Phế liệu mực
Phế liệu mực dùng trong nghiên cứu thủy phân là phế liệu thu từ các qui trình chế biến mực tuộc (Octopus dollfusi) (hình 2.1). Phế liệu mực được thu tại bàn làm việc của phân xưởng chế biến Công ty Khai Thác & Dịch Vụ Thủy Sản, số 4 Nguyễn Công Trứ, P.8, Tp.Cà Mau.
Hình 2.1. Mực tuộc
25
2.1.2. Ezyme Protease
Bao gồm: Neutrase, Alcalase, Protamex của hãng Novozymes – Denmark, Mua tại Cy Nam Giang - Tp. Hồ Chí Minh.
Bảng 2.1. Điều kiện làm việc của Neutrase, Alcalase và Protamex
Enzyme Hoạt độ (AU/g) pHopt t0opt (0C)
Alcalase 2,4 8 50-60
Neutrase 0,8 7 40-50
Protamex 1,5 7-8 50
2.1.3. Cá kèo :
Cá kèo dùng nuôi thử nghiệm có tên khoa học là Pseudapocryptes elongatus. Cá kèo được thu từ các vuông tôm tự nhiên tại Cà Mau, có khối lượng khoảng 20g/con.
Hình 2.3. Cá kèo
26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu 2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu
Phế liệu mực được thu trực tiếp trên bàn chế biến, vào tháng 04/2009 và được chuẩn bị một lần đủ để sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu. Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi thu, được cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt (có bảo quản bằng nước đá) và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu trước khi sử dụng được rửa sạch, loại bỏ túi mực, xay nhuyễn và sau đó chia thành các gói nhỏ 100g và dự trữ ở nhiệt độ - 200C.
2.2.2. Phương pháp phân tích hóa học:
* Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C tới khối lượng không đổi.
* Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldal.
* Xác định hàm lượng NNH3 bằng phương pháp chưng cất hơi nước. Tính kết quả:
(A-a) * 0,0014 * (W+1) * 1000
NNH3 = (g/kg chất khô) P
Trong đó:
0,0014: Số gam Nitơ tương đương với 1ml H2SO4 0,1N. A: Là số ml H2SO4 0,1N dùng trong cốc hứng.
a: Là số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ H2SO4 dư. P: Trọng lượng mẫu (g).
W: Lượng ẩm / chất khô
* Xác định hàm lượng Naa bằng phương pháp định lượng nitơ foocmol. Tính kết quả: Naa = NF – NNH3 B * f * 0,0014 * (W+1) * 1000 NF = (g/kg chất khô)