PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phế liệu mực được thu trực tiếp trên bàn chế biến, vào tháng 04/2009 và

được chuẩn bị một lần đủ để sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu. Yêu cầu

nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi thu,

được cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt (có bảo quản bằng nước đá) và vận chuyển

ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu trước khi sử dụng được rửa sạch, loại bỏ túi

mực, xay nhuyễn và sau đó chia thành các gói nhỏ 100g và dự trữ ở nhiệt độ - 20

C.

2.2.2. Phương pháp phân tích hóa học:

* Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105

C tới khối lượng

không đổi.

* Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldal.

* Xác định hàm lượng N

bằng phương pháp chưng cất hơi nước.

Tính kết quả:

(A-a)

0,0014

(W+1)

1000

N

= (g/kg chất khô)

P

Trong đó:

0,0014: Số gam Nitơ tương đương với 1ml H

SO

0,1N.

A: Là số ml H

SO

0,1N dùng trong cốc hứng.

a: Là số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ H

SO

dư.

P: Trọng lượng mẫu (g).

W: Lượng ẩm / chất khô

* Xác định hàm lượng N

bằng phương pháp định lượng nitơ foocmol.

Tính kết quả:

N

= N

– N

B

f

0,0014

(W+1)

1000

N

= (g/kg chất khô)

P

Trong đó:

27

B: Là số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ.

f: Là hệ số pha loãng.

P: Trọng lượng mẫu (g).

W: Lượng ẩm / chất khô

* Xác định độ thủy phân (DH %): Xác định theo phương pháp OPA (P.M.

Nielsen và cộng sự, 2001).

DH (%) = (số liên kết peptide bị cắt / tổng số liên kết peptide) x 100 %

Nguyên lý: Dựa vào khả năng tạo phức của thuốc thử OPA (O-phthaldialdehyde)

và dithiothreitol (HS- R

) với hợp chất chứa nhóm amino (H

N-R), sau đó dựa vào

độ hấp thụ trên máy đo quang phổ để tính độ thủy phân.

Hình 2.5. Phản ứng tạo phức của thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm

amino (H

N-R)

Tiến hành:

- Thuốc thử O-phthaldialdehyde (OPA) được chuẩn bị như sau: 9,550g

Na

B

O

.10H

O và 250mg sodium dodecyl sulfate (SDS) được hòa tan trong

187,5ml nước khử ion. Sau đó trộn lẫn với 200mg OPA 97% (OPA đã được hòa tan

trong 4ml ethanol) và 220mg dithiothreitol 99% (DTT). Cuối cùng cho thêm nước

đủ 250ml.

- Chuẩn bị mẫu:

+ Dịch thủy phân (1g) được trộn với 19ml dd SDS 4% và đun nóng lập tức tại

95

C trong thời gian 10 phút để bất hoạt enzyme. Sau đó đem ly tâm với vận tốc

920v/p trong 10 phút. Lấy 4ml phần dịch nổi đem pha loãng đến 50ml với nước khử

ion, dung dịch này dùng để đo độ hấp thụ.

CHO

CHO

+ SH-R

H

N-R

N-R

S-R

+

+ 2 H

O

28

+ Serin chuẩn: 50mg serine pha loãng trong 500ml nước khử ion

(0,9516meqv/l).

- Tiến hành đo:

Chuẩn bị hỗn hợp đo OD

Mẫu: 3ml OPA + 400µl dung dịch mẫu đã chuẩn bị.

Mẫu trắng : 3ml OPA + 400µl nước cất.

Mẫuserinchuẩn : 3ml OPA + 400µl serin chuẩn.

Các hỗn hợp được trộn 5 giây và giữ chính xác trong 2 phút trước khi đọc kết

quả tại 340nm trên máy đo quang phổ.

- Tính kết quả:

DH = h / h

100 (%)

Trong đó:

h = (Serine-NH

– ß) /  meqv /g protein

Serine-NH

= ((OD

– OD

)/(OD

– OD

))

0,9516meqv/l

0,05

100

(V

/V

)/P

h

, ß,  được tra theo bảng 2.2.

P: Hàm lượng protein (%)

V

= 19ml, V

= 4ml

Bảng 2.2. Giá trị các hằng số , ß, h

, của protein từ các vật liệu khác nhau

(Adler-Nissen 1986, trích từ P.M. Nielsen và cộng sự, 2001)

* Kỹ thuật điện di trên gel SDS-PAGE

Nguyên lý : Trong phương pháp này, các protein được phản ứng với các chất

hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate ) để tạo

29

thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về cực dương ( + ) của điện

trường. Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithithreitol ( DTT ) để

phá vở cầu nối disullfur ( -S-S- ) của protein và các tiểu đơn vị của chúng. Nhờ đó,

sự di chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ

thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn phân

tử có kích thước nhỏ khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất định.

2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu

a. Qui trình nghiên cứu thủy phân phế liệu mực

Hình 2.6. Qui trình thủy phân phế liệu mực

Phế liệu mực

Thuỷ phân

Phân tích

Xử lý

(loại bỏ túi mực)

Đun sôi diệt men

Xay nhuyễn

Điều chỉnh pH

(dùng NaOH 0,4N)

Thêm nước

(đạt tỷ lệ ẩm cần thiết)

Enzyme

Kết luận

30

b. Xác định loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân

Tiến hành bố trí thí nghiệm lựa chọn enzyme protease thích hợp cho quá

trình thủy phân phế liệu mực thể hiện ở hình 2.7.

Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại enzyme protease thích hợp cho

quá trình thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân phế liệu

mực bằng các loại enzyme protease khác nhau ở pH thích hợp tương ứng của từng

loại enzyme (bảng 2.1) trong điều kiện cố định thông số nhiệt độ và tỷ lệ ẩm. Riêng

lượng enzyme sử dụng theo tỷ lệ thích hợp, sao cho ở mỗi dịch mẫu thí nghiệm có

nồng độ enzyme bằng nhau (7,2 AU/100g trọng lượng chất khô). Sau các khoảng

thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm

lượng N

, N

và DH %. Từ đó chọn enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy

phân.

Phế liệu mực

Phân tích

Chọn enzyme protease thích hợp

Thuỷ phân

- Nhiệt độ và pH tương ứng với từng loại enzyme - Nồng độ enzyme 7,2 AU/100g trọng lượng chất khô - Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô) - Enzyme: Alcalase, Protamex, Neutrase

31

c. Xác định tỷ lệ enzyme protease bổ sung cho quá trình thủy phân

Tiến hành bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease (đã chọn) thích

hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực thể hiện ở hình 2.8.

Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho

quá trình thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí

nghiệm phế liệu mực bằng enzyme protease đã chọn với các tỷ lệ khác nhau trong

điều kiện cố định các thông số như: Nhiệt độ, pH, tỷ lệ ẩm. Sau các khoảng thời

gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng

N

, N

và DH %. Từ đó chọn tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy

phân.

d. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

Để khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phế liệu mực, tiến

hành bố trí thí nghiệm như hình 2.9.

Phế liệu mực

Phân tích

Chọn tỷ lệ enzyme protease thích hợp

Thuỷ phân

- Loại ezyme và pH tương ứng - Nhiệt độ 50⁰C

- Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô)

- Tỷ lệ enzyme 1, 3, 5, 7 (%) so với trọng lượng chất khô

32

Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình

thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí

nghiệm phế liệu mực ở các pH khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác

như: nhiệt độ, tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy

mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng N

, N

và DH %. Từ

đó chọn vùng pH thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực.

e. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

Tiến hành bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình

thủy phân phế liệu mực thể hiện ở hình 2.10.

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí

nghiệm phế liệu mực ở các nhiệt độ khác nhau trong điều kiện cố định các thông số

khác như: pH, tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy

Phế liệu mực

Phân tích

Chọn pH thích hợp (pH

)

Thuỷ phân

- Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô) -pH khác nhau: tự nhiên, 7, 8, 9

33

mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng N

, N

và DH %. Từ

đó chọn khoảng nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực.

Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá

trình thủy phân

f. Xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân

Hoạt động của enzyme rất nhạy cảm với môi trường, mọi sự thay đổi của

nhiệt độ hay pH cũng làm thay đổi khả năng xúc tác của enzyme. pH tối thích của

mỗi enzyme không cố định mà có thể thay đổi tùy theo nhiệt độ và ngược lại, nên

để xác định pH và nhiệt độ tối thích cho phản ứng thủy phân, đề tài tiến hành bố trí

thí nghiệm theo hai biến pH và nhiệt độ, bố trí theo kiểu N = 3

thể hiện ở hình

2.11.

Phế liệu mực

Phân tích

Chọn nhiệt độ thích hợp (t

)

Thuỷ phân

- Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô) -Nhiệt độ khác nhau: 30, 50, 60, 70 ( ⁰C)

34

Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá

trình thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân các mẫu thí

nghiệm theo hai biến pH và nhiệt độ dao động xung quanh pH

và t

vừa tìm ở trên

trong điều kiện cố định các thông số khác như: tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau một

khoảng thời gian thủy phân xác định lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học và sử

dụng phần mềm Statgraphic plus 4.0 để vẽ đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường mức

N

và DH %, từ đó xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân.

Thuỷ phân

Phân tích

Phế liệu mực

pH

Nhiệt độ Nhiệt độ Nhiệt độ

t

- 

t

t

+  t

- 

t

t

+ 

t

–  t

t

+ 

pH

- 

pH

pH

+ 

Chọn pH và nhiệt độ tối thích

Xử lý

35

g. Xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân

Tiến hành bố trí thí nghiệm tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân phế

liệu mực, thể hiện ở hình 2.12.

Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình

thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí

nghiệm phế liệu mực bằng enzyme đã chọn với tỷ lệ ẩm các mẫu khác nhau trong

điều kiện cố định các thông số như: Nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme. Sau các khoảng thời

gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng

N

, N

và DH %. Từ đó chọn tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân.

h. Xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung cho quá trình thủy phân

Trong quá trình thủy phân protein bằng phương pháp sử dụng enzyme

protease thì thường xảy ra hiện tượng phân hủy các hợp chất có chứa nitơ tạo ra

NH

gây thối hổn hợp thủy phân. Vì vậy trong quá trình thủy phân nên bổ sung các

chất phòng thối. Qua tham khảo các công trình nghiên cứu khác, chúng tôi chọn

NaCl và sorbitol kết hợp dùng làm chất phòng thối cho quá trình thủy phân phế liệu

Phế liệu mực

Phân tích

Chọn tỷ lệ ẩm thích hợp

Thuỷ phân

- Tỷ lệ ẩm 300, 400, 500, 600 ( %) so với trọng lượng chất khô

36

Thuỷ phân

Phân tích

Phế liệu mực

NaCl

Sorbitol Sorbitol Sorbitol

0

5

12 0

5

12

0

5

12

0

4 10

Chọn tỷ lệ NaCl và sorbitol

Xử lý

mực. Tiến hành bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung theo kiểu

N = 3

thể hiện ở hình 2.13.

Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung thích

hợp cho quá trình thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân các mẫu thí

nghiệm theo hai biến NaCl và sorbitol trong điều kiện cố định các thông số khác

như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau một khoảng thời gian thủy phân xác

định lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học và sử dụng phần mềm Statgraphic

plus 4.0 để vẽ đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường mức N

N

và DH %, từ đó xác

định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân.

37

i. Thử nghiệm dùng dịch thủy phân phế liệu mực làm thức ăn bổ sung

cho cá

Qui trình nuôi thử nghiệm

Hình 2.14. Qui trình nuôi thử nghiệm cá kèo bằng các dịch thủy phân phế liệu

mực

Giải thích:

* Cá Kèo: Cá kèo được thu mẫu từ các vuông tôm tự nhiên tại Cà Mau và đưa

về trại thí nghiệm thuần hóa trong bể xi măng 150cm x 150cm, nước có độ mặn

10%

. Cá kèo thử nghiệm có kích thước tương đồng và khỏe mạnh. Trong thời gian

Cá Kèo

- Lượng thức ăn cá sử dụng sau 30

phút cho ăn

- Khối lượng tăng trung bình / ngày

Kết luận

Nuôi cho ăn

thử nghiệm

(30 con / bể )

Thuần hóa và

chọn lọc cá

- Cho ăn ngày 2 lần/ ngày vào 7h và 18h

- Thời gian 10 ngày

- Bể xi măng 150cm x 150cm - Độ mặn nước: 10%o - DO= 5.5 ÷ 6.5 mg/l - pH = 7 ÷ 8

- t⁰ = 23 ÷ 27⁰C

- Cho ăn ngày 2 lần/ ngày vào 7h và 18h

- Thời gian 7 ngày

Cho ăn bằng thức ăn cá

kèo (của Cty Uni- President)

Thức ăn cá kèo (Mẫu đối chứng)

Thức ăn cá kèo có bổ

sung phế liệu mực thủy

phân từ thí nghiệm

Thức ăn cá kèo có bổ sung dịch đạm là amino complex

38

thuần hóa cho cá ăn bằng thức ăn cá kèo của công ty TNHH Uni-President trong thời

gian 7 ngày, sau đó chuyển cá vào các bể nuôi thử nghiệm.

* Dịch thủy phân: Sản xuất dịch thủy phân từ phế liệu mực với điều kiện

thủy phân là loại enzyme, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, tỷ lệ ẩm, tỷ lệ NaCl và

sorbitol thích hợp tìm được ở các thí nghiệm trên ứng với các thời gian 0, 2, 4, 6, 8

giờ. Sau đó dùng dịch thủy phân tương ứng ở 0, 2, 4, 6, 8 giờ nuôi thử nghiệm trên

cá kèo nhằm xác định khả năng kích thích bắt mồi của các dịch thủy phân và tốc độ

tăng trọng của cá khi sử dụng chúng so với các mẫu đối chứng.

* Có 7 bể nuôi thí nghiệm cho ăn bằng thức ăn có sử dụng chất bổ sung như

sau:

Bể nuôi: Thức ăn cho ăn

ĐC1: Đối chứng (không dùng chất bổ sung)

ĐC2: Ủ với amino complex, liều sử dụng 5% so với thức ăn

DTP 0h: Ủ với dịch phế liệu mực chưa thủy phân (5% so với thức ăn)

DTP 2h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 2 giờ (5% so với thức ăn)

DTP 4h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 4 giờ (5% so với thức ăn)

DTP 6h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 6 giờ (5% so với thức ăn)

DTP 8h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 8 giờ (5% so với thức ăn)

* Tính lượng thức ăn cá sử dụng sau 30 phút cho ăn:

Nuôi thí nghiệm cho cá ăn ngày 2 lần, mỗi lần ăn 150 viên thức ăn/ bể (thức

ăn dạng nổi). Sau thời gian 30 phút cho ăn, vớt và đếm số thức ăn còn lại để xác

định lượng thức ăn cá đã sử dụng trong 30 phút đầu cho ăn.

* Tính khối lượng tăng trung bình hằng ngày (Average Daily Gain)

ADG (g/con/ngày) =