a. Qui trình nghiên cứu thủy phân phế liệu mực
Hình 2.6. Qui trình thủy phân phế liệu mực
Phế liệu mực
Thuỷ phân
Phân tích Xử lý (loại bỏ túi mực)
Đun sôi diệt men Xay nhuyễn Điều chỉnh pH (dùng NaOH 0,4N) Thêm nước (đạt tỷ lệ ẩm cần thiết) Enzyme Kết luận
30
b. Xác định loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân
Tiến hành bố trí thí nghiệm lựa chọn enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực thể hiện ở hình 2.7.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân phế liệu
mực bằng các loại enzyme protease khác nhau ở pH thích hợp tương ứng của từng
loại enzyme (bảng 2.1) trong điều kiện cố định thông số nhiệt độ và tỷ lệ ẩm. Riêng lượng enzyme sử dụng theo tỷ lệ thích hợp, sao cho ở mỗi dịch mẫu thí nghiệm có nồng độ enzyme bằng nhau (7,2 AU/100g trọng lượng chất khô). Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng Naa, NNH3 và DH %. Từ đó chọn enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân.
Phế liệu mực
Phân tích
Chọn enzyme protease thích hợp
Thuỷ phân
- Nhiệt độ và pH tương ứng với từng loại enzyme - Nồng độ enzyme 7,2 AU/100g trọng lượng chất khô - Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô) - Enzyme: Alcalase, Protamex, Neutrase
31
c. Xác định tỷ lệ enzyme protease bổ sung cho quá trình thủy phân
Tiến hành bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease (đã chọn) thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực thể hiện ở hình 2.8.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí nghiệm phế liệu mực bằng enzyme protease đã chọn với các tỷ lệ khác nhau trong điều kiện cố định các thông số như: Nhiệt độ, pH, tỷ lệ ẩm. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng Naa, NNH3 và DH %. Từ đó chọn tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân.
d. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân
Để khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phế liệu mực, tiến hành bố trí thí nghiệm như hình 2.9.
Phế liệu mực
Phân tích
Chọn tỷ lệ enzyme protease thích hợp
Thuỷ phân
- Loại ezyme và pH tương ứng - Nhiệt độ 500C
- Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô)
- Tỷ lệ enzyme 1, 3, 5, 7 (%) so với trọng lượng chất khô
32
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí nghiệm phế liệu mực ở các pH khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như: nhiệt độ, tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng Naa, NNH3 và DH %. Từ đó chọn vùng pH thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực.
e. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Tiến hành bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phế liệu mực thể hiện ở hình 2.10.
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí nghiệm phế liệu mực ở các nhiệt độ khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như: pH, tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy
Phế liệu mực Phân tích Chọn pH thích hợp (pHth) Thuỷ phân - Loại ezyme và tỷ lệ đã chọn - Nhiệt độ 500C
- Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô) -pH khác nhau: tự nhiên, 7, 8, 9
33
mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng Naa, NNH3 và DH %. Từ đó chọn khoảng nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực.
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
f. Xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân
Hoạt động của enzyme rất nhạy cảm với môi trường, mọi sự thay đổi của nhiệt độ hay pH cũng làm thay đổi khả năng xúc tác của enzyme. pH tối thích của mỗi enzyme không cố định mà có thể thay đổi tùy theo nhiệt độ và ngược lại, nên để xác định pH và nhiệt độ tối thích cho phản ứng thủy phân, đề tài tiến hành bố trí thí nghiệm theo hai biến pH và nhiệt độ, bố trí theo kiểu N = 32 thể hiện ở hình 2.11. Phế liệu mực Phân tích Chọn nhiệt độ thích hợp (t0th) Thuỷ phân - Loại ezyme và tỷ lệ đã chọn - pH đã chọn
- Tỷ lệ ẩm 400 % (so với trọng lượng chất khô) -Nhiệt độ khác nhau: 30, 50, 60, 70 ( 0C)
34
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân các mẫu thí nghiệm theo hai biến pH và nhiệt độ dao động xung quanh pHth và tth vừa tìm ở trên trong điều kiện cố định các thông số khác như: tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau một khoảng thời gian thủy phân xác định lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học và sử dụng phần mềm Statgraphic plus 4.0 để vẽ đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường mức Naa và DH %, từ đó xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân.
Thuỷ phân
Phân tích Phế liệu mực
pH
Nhiệt độ Nhiệt độ Nhiệt độ
tth - tth tth + tth - tth tth + tth – tth tth + pHth - pHth pHth +
Chọn pH và nhiệt độ tối thích Xử lý
35
g. Xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân
Tiến hành bố trí thí nghiệm tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu mực, thể hiện ở hình 2.12.
Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí
nghiệm phế liệu mực bằng enzyme đã chọn với tỷ lệ ẩm các mẫu khác nhau trong
điều kiện cố định các thông số như: Nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học để xác định hàm lượng Naa, NNH3 và DH %. Từ đó chọn tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân.
h. Xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung cho quá trình thủy phân
Trong quá trình thủy phân protein bằng phương pháp sử dụng enzyme protease thì thường xảy ra hiện tượng phân hủy các hợp chất có chứa nitơ tạo ra NH3 gây thối hổn hợp thủy phân. Vì vậy trong quá trình thủy phân nên bổ sung các chất phòng thối. Qua tham khảo các công trình nghiên cứu khác, chúng tôi chọn NaCl và sorbitol kết hợp dùng làm chất phòng thối cho quá trình thủy phân phế liệu
Phế liệu mực Phân tích Chọn tỷ lệ ẩm thích hợp Thuỷ phân - Loại ezyme và tỷ lệ đã chọn - pH và nhiệt độ tối thích
- Tỷ lệ ẩm 300, 400, 500, 600 ( %) so với trọng lượng chất khô
36
Thuỷ phân
Phân tích Phế liệu mực
NaCl
Sorbitol Sorbitol Sorbitol
0 5 12 0 5 12 0 5 12 0 4 10
Chọn tỷ lệ NaCl và sorbitol Xử lý
mực. Tiến hành bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung theo kiểu N = 32 thể hiện ở hình 2.13.
Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm, đề tài tiến hành nghiên cứu thủy phân các mẫu thí nghiệm theo hai biến NaCl và sorbitol trong điều kiện cố định các thông số khác như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme, tỷ lệ ẩm. Sau một khoảng thời gian thủy phân xác định lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học và sử dụng phần mềm Statgraphic plus 4.0 để vẽ đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường mức Naa, NNH3 và DH %, từ đó xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân.
37
i. Thử nghiệm dùng dịch thủy phân phế liệu mực làm thức ăn bổ sung cho cá
Qui trình nuôi thử nghiệm
Hình 2.14. Qui trình nuôi thử nghiệm cá kèo bằng các dịch thủy phân phế liệu mực
Giải thích:
* Cá Kèo: Cá kèo được thu mẫu từ các vuông tôm tự nhiên tại Cà Mau và đưa về trại thí nghiệm thuần hóa trong bể xi măng 150cm x 150cm, nước có độ mặn 10%0. Cá kèo thử nghiệm có kích thước tương đồng và khỏe mạnh. Trong thời gian
Cá Kèo
- Lượng thức ăn cá sử dụng sau 30 phút cho ăn
- Khối lượng tăng trung bình / ngày
Kết luận Nuôi cho ăn
thử nghiệm (30 con / bể ) Thuần hóa và chọn lọc cá Kích cỡ - L: 13-14cm - W: 19-20g - Bể xi măng 150cm x 150cm - Độ mặn nước: 10%o - DO= 5.5 ÷ 6.5 mg/l - pH = 7 ÷ 8 - t0 = 23 ÷ 270C
- Cho ăn ngày 2 lần/ ngày vào 7h và 18h
- Thời gian 10 ngày
- Bể xi măng 150cm x 150cm - Độ mặn nước: 10%o - DO= 5.5 ÷ 6.5 mg/l - pH = 7 ÷ 8
- t0 = 23 ÷ 270C
- Cho ăn ngày 2 lần/ ngày vào 7h và 18h
- Thời gian 7 ngày
Cho ăn bằng thức ăn cá
kèo (của Cty Uni- President)
Thức ăn cá kèo (Mẫu đối chứng)
Thức ăn cá kèo có bổ
sung phế liệu mực thủy
phân từ thí nghiệm
Thức ăn cá kèo có bổ sung dịch đạm là amino complex
38
thuần hóa cho cá ăn bằng thức ăn cá kèo của công ty TNHH Uni-President trong thời gian 7 ngày, sau đó chuyển cá vào các bể nuôi thử nghiệm.
* Dịch thủy phân: Sản xuất dịch thủy phân từ phế liệu mực với điều kiện thủy phân là loại enzyme, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, tỷ lệ ẩm, tỷ lệ NaCl và sorbitol thích hợp tìm được ở các thí nghiệm trên ứng với các thời gian 0, 2, 4, 6, 8 giờ. Sau đó dùng dịch thủy phân tương ứng ở 0, 2, 4, 6, 8 giờ nuôi thử nghiệm trên cá kèo nhằm xác định khả năng kích thích bắt mồi của các dịch thủy phân và tốc độ tăng trọng của cá khi sử dụng chúng so với các mẫu đối chứng.
* Có 7 bể nuôi thí nghiệm cho ăn bằng thức ăn có sử dụng chất bổ sung như sau:
Bể nuôi: Thức ăn cho ăn
ĐC1: Đối chứng (không dùng chất bổ sung)
ĐC2: Ủ với amino complex, liều sử dụng 5% so với thức ăn
DTP 0h: Ủ với dịch phế liệu mực chưa thủy phân (5% so với thức ăn)
DTP 2h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 2 giờ (5% so với thức ăn) DTP 4h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 4 giờ (5% so với thức ăn) DTP 6h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 6 giờ (5% so với thức ăn) DTP 8h: Ủ với dịch phế liệu mực thủy phân ở thời điểm 8 giờ (5% so với thức ăn)
* Tính lượng thức ăn cá sử dụng sau 30 phút cho ăn:
Nuôi thí nghiệm cho cá ăn ngày 2 lần, mỗi lần ăn 150 viên thức ăn/ bể (thức ăn dạng nổi). Sau thời gian 30 phút cho ăn, vớt và đếm số thức ăn còn lại để xác định lượng thức ăn cá đã sử dụng trong 30 phút đầu cho ăn.
* Tính khối lượng tăng trung bình hằng ngày (Average Daily Gain)
ADG (g/con/ngày) = Trong đó:
KL ht: Khối lượng trung bình của cá hiện tại (g). KL t : Khối lượng trung bình của cá lần trước (g). t : Thời gian giữa 2 lần cân (ngày)
KL ht - KL t
39