Việt Nam là một nƣớc có điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thuận lợi cho việc hình thành và phát triển các loại thực vật, trong đó phải kể đến các loài thuộc chi Citrus họ Rutaceae nhƣ chanh (Citrus limonia Osbeck), bƣởi (Citrus grandis (L.) Osbeck), cam (Citrus sinensis (L.) Osbeck), quít (Citrus reticulata
Blanco)... Gần đây, ở nƣớc ta cũng đã có một số nghiên cứu tách chiết tinh dầu từ lá hay vỏ bƣởi, cam, chanh sử dụng phƣơng pháp chƣng cất truyền thống cũng nhƣ ứng dụng một số kỹ thuật chiết mới.
Nguyễn Minh Hoàng, khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Mở TPHCM đã nghiên cứu chiết tinh dầu từ vỏ trái bƣởi da xanh Citrus grandis (L.) Osbeck (trồng tại Đồng Nai) và từ vỏ trái cam sành Citrus nobilis Lour (trồng tại Tiền Giang) và vỏ trái chanh giấy Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle (trồng tại Tiền Giang) bằng phƣơng pháp chƣng cất hơi nƣớc có và không có sự hỗ trợ của vi sóng [3]. Kết quả cho thấy khi chƣng cất với nguyên liệu không xay tốn nhiều thời gian ly trích hơn và tinh dầu thu đƣợc có màu vàng do tiếp xúc nhiệt quá lâu, hiệu suất thấp (bƣởi: 0,59%; cam: 1,34%; chanh: 0,83%). Nếu dùng nguyên liệu xay thì thời gian ly trích ngắn, tinh dầu thu đƣợc trong suốt, không màu, hiệu suất thu đƣợc cao hơn (bƣởi: 1,58%; cam: 3,79%; chanh: 1,78%). Việc kết hợp sử dụng vi sóng trong quá trình chƣng cất với nguyên liệu không xay có thời gian ly trích rất ngắn (19 - 21 phút), tinh nhƣng dầu thu đƣợc có màu vàng nhạt và hiệu suất thấp (bƣởi: 0,51%; cam: 0,48%; chanh: 0,40%). Kết quả thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tinh dầu vỏ trái giống Citrus kháng khuẩn tốt trên một số chủng vi khuẩn thử nghiệm.
Tuy nhiên, hầu hết các công trình trong nƣớc đều tập trung khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu và chƣa nghiên cứu đầy đủ các yếu
tố ảnh hƣởng tới hiệu suất chiết tinh dầu để làm cơ sở khoa học cho việc sản xuất trên quy mô công nghiệp. Hơn nữa, chƣa thấy công trình nghiên cứu nào về tinh dầu vỏ quả bƣởi Năm Roi.
Vì vậy, trong đề tài này, tôi sẽ nghiên cứu các vấn đề sau:
- Xác lập điều kiện tối ƣu cho việc tách chiết tinh dầu từ vỏ bƣởi Năm Roi bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc.
- Áp dụng quy trình để thu nhận tinh dầu vỏ bƣởi Năm Roi. Đánh giá hiệu quả kinh tế của quy trình đã xây dựng.
- Xác định các chỉ số lý-hóa cơ bản và thành phần hóa học của sản phẩm. Từ đó, đánh giá chất lƣợng tinh dầu thu nhận đƣợc.
Chƣơng 2.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu chính
Nguyên liệu sử dụng tách tinh dầu trong nghiên cứu này là vỏ quả bƣởi Năm Roi (Citrus grandis L. Osbeck var. Grandis) có nguồn gốc từ các tỉnh miền Tây và đƣợc thu mua ở chợ Vĩnh Hải (Nha Trang). Chỉ chọn quả bƣởi tƣơi, có vỏ màu sáng, bóng và không bị nấm mốc.
2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất
a. Dụng cụ - Thiết bị
- Cân kỹ thuật 1 mg (Shimadzu, Nhật) - Cân phân tích 0,1 mg (Satorius, Nhật) - Cân kỹ thuật 1 g (Việt Nam)
- Bộ chƣng cất tinh dầu định lƣợng, có hồi lƣu kiểu Clevenger dùng cho tinh dầu nhẹ hơn nƣớc (ISOLAB, Đức)
- Bếp đun bình cầu 1000 ml (Trung Quốc) - Máy xay điện (Sanyo, Nhật)
- Tủ sấy 10
C (Memmert , Đức) - Tủ lạnh trữ mẫu -200
C.
- Bình đo tỷ trọng 25 ml (Bomex, Trung Quốc) - Buret, pipet, bình tam giác
- Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ hai lần với thiết bị GC model G3440A của hãng Agilent (Agilent, USA) ghép với detector MS/MS model Quattro microTMGC của hãng Waters (USA)
b. Hóa chất
- Nƣớc cất 1 lần - Na2SO4 khan - Etanol 95%
- Dung dịch chỉ thị phenolphtalein 1% - Dung dịch KOH 0,1 N và 0,5 N - Dung dịch HCl 0,5 N
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định thành phần khối lƣợng của quả bƣởi Năm Roi
Bƣởi Năm Roi đƣợc rửa sạch và lau khô nƣớc. Sau đó, xác định thành phần khối lƣợng của bƣởi nhƣ sau:
- Cân quả bƣởi đƣợc khối lƣợng là mQ
- Gọt lấy phần vỏ xanh rất mỏng bên ngoài quả bƣởi và có chứa các túi tinh dầu. Đem cân phần này ta đƣợc khối lƣợng mV
- Lột lấy phần cùi bƣởi bao gồm cả phần xơ màu trắng (sát phần múi bƣởi), gộp lại rồi đem cân ta đƣợc khối lƣợng mC
- Phần ruột quả (múi quả) đem cân ta đƣợc khối lƣợng là mR Thành phần khối lƣợng của quả bƣởi Năm Roi đƣợc tính nhƣ sau:
%Vỏ = .100% mQ mV ; %Cùi = .100% mQ mC ; %Ruột = .100% mQ mR
2.2.2. Chuẩn bị nguyên liệu
Phần vỏ xanh của quả bƣởi đƣợc cắt nhỏ, trộn đều để đồng nhất mẫu. Cân thành nhiều mẫu có khối lƣợng chính xác (mỗi mẫu khoảng 100g), sau đó cho vào các túi polyetylen, cột kín để hạn chế không khí tới mức tối đa, rồi đem bảo quản ở nhiệt độ -200C đến khi nghiên cứu.
2.2.3. Đề xuất quy trình tách chiết tinh dầu từ vỏ bƣởi
Quy trình dự kiến tách chiết tinh dầu vỏ bƣởi bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc đƣợc trình bày trên hình 2.1.
Thuyết minh quy trình:
Vỏ bƣởi Năm Roi đƣợc trộn với nƣớc có hòa tan NaCl, sau đó đem xay nhỏ bằng máy xay trong 2 phút rồi ngâm trong một thời gian thích hợp. Tiến hành chƣng cất để thu tinh dầu. Tinh dầu đƣợc làm khan bằng Na2SO4, sau đó đem xác định chỉ số hóa-lý và định danh các cấu tử có trong tinh dầu.
Na2SO4(khan)
Hình 2.1.Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết tinh dầu từ vỏ bƣởi
Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi chọn các yếu tố có thể ảnh hƣởng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu và khoảng giá trị khảo sát nhƣ sau:
Xay (2 phút)
Ngâm
Chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Phân ly Ngƣng tụ
Tinh dầu thô Làm khan Lắng, gạn Tinh dầu Nguyên liệu Tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu (v/w) thích hợp Nồng độ NaCl (w/v) thích hợp
Thời gian ngâm thích hợp
Thời gian chƣng cất thích hợp
Xử lý
Xác định tính
- Tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu, X1 = 2,0 4,0 (v/w)
- Nồng độ NaCl trong dịch ngâm X2= 0,0 20% (w/v) - Thời gian ngâm NaCl, X3 = 60 300 (phút)
- Thời gian chƣng cất, X4 = 0 180 (phút)
Để đánh giá ảnh hƣởng của các yếu tố trên đến hiệu suất thu hồi tinh dầu, trƣớc hết chúng tôi dùng phƣơng pháp thực nghiệm yếu tố từng phần (thay đổi từng thông số trong khi cố định các thông số còn lại). Sau đó, quy hoạch thực nghiệm toàn phần để xác định chính xác hơn giá trị tối ƣu của các thông số trên.
2.2.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu
2.2.4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/nguyên liệu (v/w)
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu thích hợp
Để xác định tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu thích hợp, chúng tôi tiến hành lô thí nghiệm sau:
Nguyên liệu
Xay với tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu, X1(v/w)
Chƣng cất ( 90 phút)
Đo thể tích tinh dầu thu đƣợc
2,0/1 2,5/1 3,0/1 3,5/1 4,0/1
Tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu thích hợp
Lấy 100g nguyên liệu cho vào máy xay điện, thêm vào đó một lƣợng nƣớc cất trong đó tỷ lệ nƣớc /nguyên liệu thay đổi lần lƣợt là: 2,0/1; 2,5/1; 3,0/1; 3,5/1; 4,0/1 (v/w), đồng thời bổ sung thêm muối NaCl sao cho đạt 5% (w/v). Xay trong 2 phút. Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chƣng cất và ngâm trong 120 phút. Chƣng hỗn hợp trong 90 phút dƣới áp suất khí quyển. Đọc thể tích tinh dầu tách ra trên ống ngƣng tụ (có khắc vạch thể tích) và so sánh. Từ đó, chọn tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu thích hợp.
2.2.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong dịch ngâm
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ muối NaCl thích hợp
Nồng độ NaCl thích hợp trong dịch ngâm đƣợc xác định qua lô thí nghiệm sau:
Xay (Tỷ lệ X1 thích hợp)
Ngâm (120 phút)
Đo thể tích tinh dầu thu đƣợc
0% 5% 10% 15% 20%
Bổ sung NaCl sao cho nồng độ NaCl trong dịch ngâm thay đổi, X2 (w/v) Nguyên liệu
Chƣng cất (90 phút)
Lấy 100g nguyên liệu cho vào máy xay điện, thêm vào đó một lƣợng nƣớc cất với tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu thích hợp. Thêm NaCl vào hỗn hợp, trong đó nồng độ NaCl thay đổi lần lƣợt là: 0%, 5%, 10%, 15%, 20% (w/v). Xay trong 2 phút. Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chƣng cất và ngâm trong 120 phút. Chƣng hỗn hợp trong 90 phút dƣới áp suất khí quyển. Đọc thể tích tinh dầu tách ra trên ống ngƣng tụ và so sánh. Từ đó, chọn nồng độ NaCl thích hợp.
2.2.4.3. Ảnh hưởng của thời gian ngâm muối NaCl
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ngâm muối NaCl thích
hợp
Để chọn thời gian ngâm muối thích hợp, chúng tôi tiến hành lô thí nghiệm nhƣ sau:
Xay (tỷ lệ X1, nồng độ X2 thích hợp)
Chƣng cất ( 90 phút)
Đo thể tích tinh dầu thu đƣợc
1h 2h 3h 4h 5h
Thời gian ngâm NaCl thích hợp
Ngâm (X3)
Lấy 100g nguyên liệu cho vào máy xay điện, thêm vào đó một lƣợng nƣớc cất và NaCl với tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu và nồng độ NaCl thích hợp đã chọn. Xay trong 2 phút. Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chƣng cất. Thay đổi thời gian ngâm nguyên liệu lần lƣợt là: 1; 2; 3; 4; 5 (giờ). Sau đó, chƣng cất hỗn hợp trong 90 phút dƣới áp suất khí quyển. Đọc thể tích tinh dầu tách ra trên ống ngƣng tụ và so sánh. Từ đó, chọn thời gian ngâm muối thích hợp.
2.2.4.4. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất
Thời gian chƣng cất là một thông số ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất cũng nhƣ chất lƣợng của tinh dầu thu đƣợc. Nếu thời gian chƣng cất quá ngắn, hiệu suất thu hồi tinh dầu sẽ thấp, ngƣợc lại nếu thời gian chƣng cất quá lâu sẽ ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng của tinh dầu, tiêu tốn năng lƣợng.
Để xác định thời gian chƣng cất thích hợp, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chƣng cất thích hợp
Cho mẫu vào bình cầu trong đó cố định các thông số đã chọn ở trên và tiến hành chƣng cất. Cứ sau 15 phút ghi kết quả thể tích tinh dầu thu đƣợc cho đến khi
Xay (tỷ lệ X1, X2 thích hợp)
Cứ sau 15 phút đọc thể tích tinh dầu thu đƣợc
Thời gian chƣng cất thích hợp
Ngâm (thời gian thích hợp) Nguyên liệu
thấy thể tích tinh dầu không tăng đƣợc nữa thì ngừng (Thời gian chƣng cất đƣợc tính từ lúc hơi nƣớc và tinh dầu ngƣng tụ giọt đầu tiên trong ống ngƣng tụ). Đánh giá kết quả dựa vào thể tích tinh dầu thu đƣợc.
2.2.5. Tối ƣu hóa quy trình tách chiết tinh dầu
Để xác định chính xác giá trị tối ƣu của các thông số ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa quá trình tách chiết bằng phƣơng pháp thực nghiệm yếu tố toàn phần theo mô hình Box-Wilson trong đó sử dụng phƣơng án trực giao bốn yếu tố với 3 thí nghiệm lặp lại ở tâm phƣơng án (k = 4, N0= 3). Nhƣ vậy, phƣơng án thực nghiệm bao gồm 27 thí nghiệm (16 thí nghiêm ở biên, 3 thí nghiệm ở tâm và 8 thí nghiệm ở các cánh tay đòn).
Hàm mục tiêu là thể tích tinh dầu chƣng cất đƣợc (Y)
Phƣơng trình hồi quy tuyến tính có dạng bậc 2 đƣợc xác định bằng phần mềm EXCEL 2003: 2 4 44 2 3 33 4 4 3 3 2 2 1 1 0 bX b X b X b X ... b X b X b Y
Sau khi loại bỏ các hệ số không có ý nghĩa bằng chuẩn Student và kiểm định tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy với thực nghiệm chuẩn bằng chuẩn Fisher (độ tin cậy P = 0,95), tiến hành xác định giá trị tối ƣu của các thông số bằng phần mềm Maple 7.0.
Bảng 2.1. Các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hƣởng đến
hiệu suất thu hồi tinh dầu Yếu tố Ký hiệu Các mức Khoản g biến thiên Mức trên +1 Mức cơ sở 0 Mức dƣới –1 Nƣớc/nguyên liệu (v/w) X1 4/1 3/1 2/1 1/1 Nồng độ NaCl (%, w/v) X2 20 12,5 5 7,5
Thời gian ngâm NaCl (h) X3 5 3 1 2
2.2.6. Thử nghiệm quy trình chƣng cất- Đánh giá hiệu suất và chất lƣợng tinh dầu thu đƣợc
2.2.6.1. Thử nghiệm quy trình chưng cất - Đánh giá hiệu suất thu hồi tinh dầu
Tiến hành 3 thí nghiệm song song tách chiết tinh dầu từ vỏ bƣởi nguyên liệu trong điều kiện tối ƣu đã xác lập.
Sau khi chƣng cất, để lắng hỗn hợp trong ống ngƣng tụ đến khi tách hẳn thành 2 pha riêng biệt. Đọc thể tích tinh dầu trên ống ngƣng tụ.
Hiệu suất thu hồi tinh dầu đƣợc tính theo công thức:
% 100 . ) / ( % NL TD m V w v Trong đó:
: Hiệu suất thu hồi tinh dầu (%) VTD : Thể tích tinh dầu thu đƣợc (ml)
mNL: Khối lƣợng nguyên liệu (tƣơi hay khô) đem chƣng cất
2.2.6.2. Xác định các tính chất lý- hóa cơ bản của tinh dầu
Lƣợng tinh dầu sau khi chƣng cất và làm khan nhƣ trên đƣợc đem xác định các chỉ số lý-hóa nhƣ sau:
- Xác định tỷ trọng ở 200
C (d20): phƣơng pháp khối lƣợng, dùng bình đo tỷ trọng (Phụ lục 2)
- Xác định chỉ số acid (IA), chỉ số ester (IE) và chỉ số xà phòng hóa (IS) : phƣơng pháp chuẩn độ (Phụ lục 2)
2.2.6.3. Định danh các cấu tử có trong tinh dầu vỏ bưởi
Phát hiện sự có mặt của các cấu tử có trong tinh dầu vỏ bƣởi tại Trung tâm Phân tích và Phân loại hàng hoá xuất khẩu nhập khẩu Miền Trung (số 10 Ngô Quyền, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng) trên thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ 2 lần (GC/MS/MS), trong đó: thiết bị GC model G3440A (Agilent Technologies, USA), detector MS model Quattro microTMGC (Waters, USA).
Điều kiện chạy sắc ký:
- Cột phân tích: HP5-MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) của Agilent (USA). - Khí mang: He 99,99% ; Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút
- Detector khối phổ MS/MS: phân tích bằng kỹ thuật EI (Phụ lục 7) - Nhiệt độ detector và buồng tiêm mẫu: 2500C.
- Pha loãng mẫu 3-5% trong n-hexan. Chia dòng 100:1. - Chƣơng trình nhiệt độ:
Nhiệt độ đầu là 400C; tăng đến 2000
C (30C/phút); giữ trong 2 phút; tăng đến 2500C (30C/phút); tăng đến 3000C (200C/phút) và giữ trong 10 phút.
Hình 2.6. Chƣơng trình nhiệt độ khi phân tích tinh dầu vỏ bƣởi bằng phƣơng pháp GC/MS/MS
- Việc định danh các thành phần trong tinh dầu đƣợc thực hiện bằng cách dùng phần mềm cài đặt sẵn trên máy để so sánh các phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn có trong thƣ viện phổ của NIST2 và của hãng WATERS.
- Mức độ phù hợp giữa chất có trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị đƣợc tính bằng đại lƣợng độ tương thích. Độ tƣơng thích càng cao thì kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hoàn toàn giống với phổ khối
2 NIST (viết tắt của cụm từ “The National Institute of Standards and Technology”): Viện Tiêu chuẩn và Công
nghệ Quốc gia Hoa Kỳ
40oC 200oC-2phút 250oC 300oC-10 phút 3oC/phút 3oC/phút 20oC/phút
của một chất chuẩn trong thƣ viện thì độ tƣơng thích là đƣợc biểu thị là 1.000. Độ tƣơng thích đạt trên 800 đƣợc xem là cho kết quả có độ tin cậy cao.
2.2.7. Xử lý số liệu
Các kết quả nghiên cứu đều là trung bình cộng của 3 lần xác định song song. Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2003.
Vẽ đồ thị hai chiều bằng phần mềm Excel 2003 và đồ thị ba chiều bằng phần mềm Maple 7.0
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định thành phần khối lƣợng của quả bƣởi Năm Roi
Kết quả xác định thành phần khối lƣợng của quả bƣởi Năm Roi đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần khối lƣợng của quả bƣởi Năm Roi
Mẫu
Vỏ
(phần chứa tinh dầu)
Ruột
(phần múi bưởi)
Cùi
(phần cùi bưởi màu trắng)
Khối lƣợng (kg) Tỷ lệ (%) Khối lƣợng (kg) Tỷ lệ (%) Khối lƣợng (kg) Tỷ lệ (%) 1 0,24 20,00 0,68 56,67 0,28 23,33