Mẫu tôm bị bệnh nhưng còn sống và mẫu tôm khỏe ở nghiệm thức đối chứng
được thu tại nơi thí nghiệm, cố định bằng dung dịch Davidson (là hỗn hợp của cồn etanol, Formalin và acid acetic). 0.5- 1 ml (CC) dung dịch cố định được tiêm vào
phần đầu ngực của mỗi con tôm, sau đó mẫu tôm này được ngâm trong dung dịch cốđịnh với tỷ lệ về thể tích là 1/10, sau 36-48h các mẫu này được chuyển sang cồn etanol 70% để bảo quản. Các tiêu bản mô bệnh học được làm theo phương pháp mô bệnh học truyền thống, áp dụng cho động vật giáp xác và đã được giới thiệu bởi Lightner, D.V, 1996. [35].
2.4.3. Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường.
Độ mặn (S‰) được xác định bằng khúc xạ kế trước và sau khi kết thúc thí nghiệm.
Nhiệt độ nước được đo hàng ngày, tại 2 thời điểm là 6h và 14h.
pH nước được đo hàng ngày bằng máy đo pH chạy pin, ở 2 thời điểm là 6h và 14h.
2.4.4. Phương pháp xác định sinh trưởng của tôm trong thí nghiệm.
Đểđánh giá ảnh hưởng của các chế phẩm Diệp Hạ Châu và Fucoidan tới tôm thí nghiệm, kích thước và khối lượng tôm trong 3 nghiệm thức đối chứng (ĐC-1,
ĐC-2 và ĐC-3) đã được cân và đo trước và sau thí nghiệm.
Chiều dài toàn thân của tôm được đo từ chớp tủy đến chớp đuôi bằng thước
đo có độ chính xác 0.1 mm. Khối lượng tôm được đo bằng cân điện tử có độ chính xác 0.1mg. Trước khi cân, tôm đã được làm khô bằng một giấy thấm.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu.
Các số liệu thu được ở các thí nghiệm được xử lý trên phần mềm SPSS 17.0 cho Window. Sử dụng phân tích phương sai Anova một yếu tốđể so sánh tỷ lệ chết tích lũy trung bình giữa các nghiệm thức của thí nghiệm với nhau và so với đối chứng.
Tỉ lệ tôm chết tích lũy được tính theo công thức:
Số tôm chốt dốn đốn mốt thối điốm Tổng số tôm đưa vào thí nghiệm
Khối lượng trung bình hoặc chiều dài trung bình của tôm được xác định theo công thức sau:
W (g) = Tổtng khối lượng tôm đem cân
ổng số con tôm đem cân L (cm) = Tổng chiTổng sều dài tôm ố con đem đđem o đo
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả dùng 2 sản phẩm Fucoidan và Diệp Hạ Châu để ngăn chặn sự
bùng phát hội chứng chết đỏ do WSSV gây ra ở tôm chân trắng (Litopennaeus vennamei).
3.1.1. Kết quả đợt thí nghiệm thứ nhất
Đợt thí nghiệm này đã bắt đầu từ ngày 23/5/2011 và kết thúc vào ngày 7/6/2011. Đàn tôm khỏe (âm tính với WSSV khi kiểm tra bằng kỹ thuật PCR) dùng cho thí nghiệm được bắt từ một ao tôm nuôi thương phẩm đã nuôi được 40 ngày, tại Cam Ranh, có khối lượng trung bình 3,14 ± 0,20g/con. Tôm này đã được thuần dưỡng 7 ngày tại cơ sở thực nghiệm trước khi bắt đầu thí nghiệm, bố trí 30 con/nghiệm thức. Mô hình và cách tổ chức thí nghiệm đã được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu (trang 25). Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện môi trường như sau:
Độ mặn: 29 ± 1‰,
Nhiệt độ nước dao động trong khoảng: 27,0- 310C, pH nước: 7-8.
DO: sục khí liên tục 24h/ngày đêm
Theo Wongmaneeprateep & ctv (2010), khi đã bị nhiễm WSSV, hội chứng
đốm trắng (WSS) ở tôm chân trắng sẽ bùng phát rất nhanh ở nhiệt độ nước 28 ±10C và hầu như không xuất hiện bệnh lý khi tôm đã (+) với WSSV nhưng được nuôi ở
nhiệt độ 32 ± 10C [63], [64]. Do vậy, thí nghiệm này diễn ra trong điều kiện nhiệt
độ 27,0- 30,20C đã hoàn toàn thích hợp để hội chứng WSS bùng phát ở các nghiệm thức mà tôm đã bị cảm nhiễm WSSV.
3.1.1.1. Tỷ lệ chết tích lũy (%) của tôm sau 14 ngày thí nghiệm của đợt I.
Tôm thí nghiệm đã được dùng thức ăn đã trộn với thuốc (Fucoidan hoặc Diệp Hạ Châu) trong 7 ngày, xác của tôm chân trắng bị chết do hội chứng chết đỏ
(dương tính với WSSV bằng kỹ thuật PCR) đã được dùng để cảm nhiễm cho tôm thí nghiệm bằng cách cho ăn ở nghiệm thức ĐC(+) và các nghiệm thức: NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6 trong 30h, sau thời gian này tôm thí nghiệm lại được cho
ăn thức ăn đã trộn thuốc đến khi kết thúc thí nghiệm. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm ở
Hình 3.2. Diễn biến nhiệt độ nước ởđợt thí nghiệm thứ I.
Bảng 3.1: Tỉ lệ (%) chết tích lũy trung bình của tôm ở các nghiệm thức theo ngày của đợt thí nghiệm I
Các nghiệm thức đối chứng Các nghiệm thức dùng
Fucoidan Các nghiệHm thạ Châu ức dùng Diệp Ngày TN ĐC-1 ĐC-2 DC-3 ĐC + NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 23,33 8,34 13,51 15,23 25,00 18,33 12,59 10 0 0 0 60,00 33,34 22,07 40,75 38,34 51,67 57,93 11 0 0 0 76,67 63,33 44,03 72,93 61,67 85,00 79,83 12 0 0 0 86,67 80,00 71,15 90,00 80,00 93,34 88,28 13 1,67 0 0 90,00 95,00 91,50 100,0 95,00 100,0 100,0 14 1,67 0 0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Chú thích:
*. Ngày thứ 8 là thời điểm cảm nhiễm bằng cách cho ăn xác tôm bị hội chứng chết đỏ. - Liều lượng dùng Fucoidan ở các nghiệm thức NT1, NT2 và NT3 lần lượt là:
200, 400 và 600 mg/kg tôm
Liều lượng dùng Diệp Hạ Châu ở các nghiệm thức NT4, NT5 và NT6 lần lượt là: 1, 2 và 3 g/kg thức ăn.
Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.3 đã cho ta thấy, dù đã được dùng thức ăn có trộn với thuốc Fucoidan (200, 400 và 600mg/kg tôm) hoặc với Diệp Hạ
Châu (1, 2 và 3g/kg thức ăn) trước và sau khi cảm nhiễm, nhưng tôm ở các nghiệm thức này vẫn bắt đầu chết ở 35h tính từ khi bắt đầu cảm nhiễm, tương tự như hiện tượng tôm chết đã quan sát được ở nghiệm thức đối chứng dương, và chết 100% vào ngày thứ 7 sau cảm nhiễm (vào ngày thí nghiệm thứ 14).
Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy tôm ở các nghiệm thức đối chứng âm (ĐC- 1, ĐC-2 và ĐC-3) có tỷ lệ sống rất cao sau 14 ngày thí nghiệm (96,67-100%), tôm thí nghiệm đã hoàn toàn không chết ở các lô đối chứng dùng thức ăn trộn với
Fucoidan (ĐC-2) và Diệp Hạ châu (ĐC-3) với liều cao. Điều này đã cho thấy, 2 sản phẩm được chiết rút từ thảo dược này đã an toàn cho tôm, không ảnh hưởng gì tới tỷ lệ sống của tôm. .
Bảng 3.2.So sánh thống kê về tỷ lệ chết trung bình của tôm ở các nghiệm thức sau khi đã bị cảm nhiễm đợt I (cảm nhiễm vào ngày thứ 8 của thí nghiệm)
Tỉ lệ (%) tôm chết tích lũy trung bình theo ngày thí nghiệm Các nghiệm thức Ngày 9 (2 ngày sau cảm nhiễm) Ngày 10 (3 ngày sau cảm nhiễm) Ngày 11 (4 ngày sau cảm nhiễm) Ngày 12 (5 ngày sau cảm nhiễm) Ngày13 (6 ngày sau cảm nhiễm) ĐC+ 23,33 ± 3,34bc 60,00 ± 3,33d 76,67 ± 6,67bc 86,67 ± 3,34ab 90,00 ± 0,00a NT1 8,34 ± 1,67a 33,34 ± 6,67b 63,33 ± 10,00b 80,00 ± 3,33ab 95,00 ± 5,00ab NT2 13,51 ± 3,17ab 22,07 ± 2,07a 44,03 ± 2,65a 71,15 ± 2,18a 91,50 ± 1,84a NT3 15,23 ± 1,44bc 40,75 ± 4,08bc 72,93 ± 2,93bc 90,00 ± 10,00b 100,00 ± 0,00b NT4 25,00 ± 5,00c 38,34 ± 1,67b 61,67 ± 5,00b 80,00 ± 6,67ab 95,00 ± 1,67ab NT5 18,33 ± 5,00abc 51,67 ± 1,67cd 85,00 ± 1,67c 93,34 ± 3,34b 100,00 ± 0,00b NT6 12,59 ± 0,75ab 57,93 ± 2,07d 79,83 ± 0,17bc 88,28 ± 1,61ab 100,00 ± 0,00b
Chú thích: Các chữ cái khác nhau viết kèm các số theo cột dọc thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh bằng ANOVA một yếu tố.
Kết quả thể hiện ở bảng 3.2 đã cho thấy, ở ngày thứ 2 và thứ 3 sau cảm nhiễm tỷ lệ tôm chết ở các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4 và NT6 đã thấp hơn khá nhiều so với nghiệm thức ĐC+. Tuy nhiên, khi dùng thống kê để so sánh thì chỉ
có tỷ lệ chết ở các nghiệm thức NT1 ở ngày thứ 2 sau cam rnhiễm và NT1, NT2, NT3 (dùng Fucoidan với liều tương ứng 200, 400, 600 mg/kg tôm) và NT4 dùng Diệp Hạ Châu với liều 1g/kg thức ăn) ở ngày thứ 3 sau cảm nhiễm mới thấp hơn có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng dương.
Tuy nhiên, sang đến các ngày thứ 4, 5, 6 và 7 sau cảm nhiễm, đã không tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa ( p>0,05) về tỷ lệ chết trung bình ở các nghiệm thức có
dùng Fucoidan hoặc Diệp hạ Châu so với nghiệm thức đối chứng dương (không dùng thuốc để phòng bệnh).
Như vậy, dùng Fucoidan sản xuất từ rong mơ với liều: 200, 400 và 600mg/kg tôm và cao Diệp Hạ Châu với liều 1, 2 và 3g/kg thức ăn, dùng cho tôm ăn trước 1 tuần và sau khi cảm nhiễm WSSV bằng cách cho tôm ăn xác của tôm bệnh đã không có tác dụng giảm tỷ lệ chết của tôm khi chúng bị cảm nhiễm bới WSSV, tôm trong các nghiệm thức này đã chết 100% sau 7 ngày bị cảm nhiễm. Tôm chết đã bộc lộ dấu hiệu đặc thù của hội chứng chết đỏ do WSSV gây ra ở tôm chân trắng.
3.1.1.2. Mô tả các dấu hiệu và trạng thái bệnh lý của tôm sau cảm nhiễm.
Hình 3.4. Hình ảnh tôm khỏe và tôm sau thí nghiệm phòng bệnh bằng Fucoidan và Diệp hạ Châu:
1. Tôm ở NT đối chứng âm; 2. Tôm sau cảm nhiễm 2 ngày ở NT5; 3 &.4. Tôm khỏe và tôm bệnh với mầu đỏ bầm sau cảm nhiễm; 5. Đốm trắng ở giáp đầu ngực tôm bệnh ở ngày thứ 4 sau cảm nhiễm.
4 3
2 1
Trong đợt thí nghiệm thứ nhất, 30h là thời gian tôm ở các nghiệm thức ĐC+, NT1, NT2, Nt3, NT4, NT5 và NT6 được tiếp xúc và ăn xác tôm đã chết do hội chứng chết đỏ, thì tôm ở các nghiệm thức này đã bộc lộ dấu hiệu và trạng thái bất thường chỉ 35 h sau khi dừng cho ăn xác tôm bệnh (35h kể từ khi bắt đầu cho ăn xác tôm bệnh) và bệnh lý của tôm diễn biến rất nhanh. Tôm bệnh nổi lờđờ lên mặt bể thí nghiệm, ruột không có hoặc ít thức ăn, cơ thể chuyển dần sang màu đỏ bầm, vài giờ sau tôm bệnh chìm xuống đáy bể thí nghiệm, không giữ được thăng bằng, nằm nghiêng ởđáy và chết nhanh sau đó vài giờ
Đặc biệt, những con tôm chết sớm ở ngày thứ 2 sau cảm nhiễm hầu như
không xuất hiện dấu hiệu đốm trắng ở mặt dưới giáp đầu ngực, chỉ thấy cơ thể bộc lộ dấu hiện đỏ bầm, yếu dần rồi chết. Nhưng dấu hiệu đốm trắng ở giáp đầu ngực đã xuất hiện ở nhưng con tôm bị bệnh muộn hơn, ở các ngày thứ 4, 5, 6 và 7 sau cảm nhiễm.
3.1.1.3. Kiểm tra PCR và mô bệnh học các mẫu tôm trước và sau đợt thí
nghiệm I
Tôm khỏe đưa vào thí nghiệm, tôm bệnh dùng làm bệnh phẩm cảm nhiễm, các mẫu tôm bệnh thu được sau thí nghiệm và mẫu tôm thu từ các nghiệm thức đối chứng âm, dương đã được đưa vào kiểm tra WSSV bằng kỹ thuật PCR và phương pháp mô bệnh học. Kết quả kiểm tra được thể hiện ở bảng 3.3.
Kết quả kiểm tra ở bảng 3.3. đã thể hiện, đàn tôm khỏe đưa vào cảm nhiễm
đã hoàn toàn âm tính với WSSV và ngược lại, mẫu tôm chết do hội chứng chết đỏ
thu từ một ao tôm ở Ninh Hòa đã dương tính với WSSV. Sau thí nghiệm kéo dài 14 ngày, mẫu tôm thu từ 3 nghiệm thức đối chứng âm (ĐC-1, ĐC-2 và ĐC-3) vẫn hoàn toàn âm tính với WSSV tương ứng với một tỷ lệ sống rất cao sau 14 ngày thí nghiệm (96,67-100%). Ngược lại, các mẫu tôm thu từ các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4, NT5, NT6 và đối chứng dương (ĐC+) sau cảm nhiễm đã đều thể hiện (100%) dương tính với WSSV bằng kỹ thuật PCR và mô bệnh học, tương ứng với các tỷ lệ chết rất cao và chết 100% ở ngày thí 7 sau cảm nhiễm. Điều này đã cho
thấy rằng, 2 sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược là Fucoidan (với liều 200, 400 và 600 mg/kh tôm) và Diệp hạ Châu (với liều dùng 1, 2 và 3 g/kg thức ăn) đã không có hiệu quả kìm hãm sự xâm nhập cũng như sự bùng phát cú hội chứng chết đỏ do WSSV ở tôm chân trắng trong điều kiện thí nghiệm.
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra các mẫu tôm trước và sau thí nghiệm phòng bệnh đợt I
Kết quả kiểm tra sự nhiễm WSSV ở tôm thí nghiệm Nghiệm thức thí nghiệm
PCR MÔ BỆNH HỌC
Tôm khỏe trước TN - -
Tôm bị hội chứng chết đỏ dùng
cho cảm nhiễm + +
KẾT QUẢ KIỂM TRA TÔM SAU THÍ NGHIỆM PHÒNG BỆNH
Mẫu thu từ ĐC-1 - - Mẫu thu từ ĐC-2 - - Mẫu thu từ ĐC-3 - - Mẫu thu từ ĐC+ + + Mẫu thu từ NT1 + + Mẫu thu từ NT2 + + Mẫu thu từ NT3 + + Mẫu thu từ NT4 + + Mẫu thu từ NT5 + + Mẫu thu từ NT6 + +
Dưới kính hiển vi quang học ởđộ phóng đại >/= 400x, các biến đổi mô bệnh học
đặc thù cho hội chứng đốm trắng (WSSV) đã quan sát được ở một số cơ quan như: biểu mô dưới vỏ kitin, mang, dạ dày,…. của các con tôm bị hội chứng chết đỏ từ thí nghiệm này. Một dạng thể vùi (inclusion body) hình cầu hoặc hình trứng, bắt mầu tím
đồng đều của hematoxylin đã được quan sát thấy rất phổ biến trong nhân phình to của các tế bào ở biểu mô mang, dạ dày, biểu mô dưới vỏ kitin và một số cơ quan khác.
Biến đổi mô bệnh học dạng này đã được xác nhận trong kết quả nghiên cứu về hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) ở đề tài luận văn thạc sỹ của học viên Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2011).[ tài liệu chưa công bố]
Tương tự như vậy, các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào đã quan sát được
ở tôm chân trắng sau thí nghiệm này cũng tương tự như các thông báo của Flegel (2006) và Lightner (1996) về đặc điểm mô bệnh học của tôm chân trắng
(Litopenaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon) khi bị nhiễm hội chứng đốm trắng (WSS) do virus WSSV. [25],[35]
Hình 3.5. Hình ảnh về bệnh lý ở mô và tế bào của tôm chân trắng (Litopenaeus
vannamei) bị hội chứng chết đỏ do WSSV trong điều kiện thínghiệm: các thể vùi hình cầu hoặc hình trứng nằm trong nhân tế bào của các tổ chức: mang, dạ dày, biểu mô dưới vỏ.
1. Biểu mô dưới vỏở tôm khỏe; 2. Biểu mô dưới vỏở tôm bệnh; 3. Biểu mô ở
các phần phụ bụng của tômbị bệnh; 4. Biểu mô dạ dày của tôm bị bệnh.
1 2
3.1.2. Kết quả thí nghiệm đợt thứ II
Đợt thí nghiệm thứ II đã bắt đầu từ ngày 12/6/2011 và kết thúc vào ngày 22/6/2011. Đàn tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) khỏe (âm tính với WSSV khi kiểm tra bằng kỹ thuật PCR) dùng cho thí nghiệm được bắt từ một ao tôm nuôi thương phẩm tại Cam Ranh, có khối lượng trung bình 4.78 ± 0.16g/con. Cũng như đợt I, tôm bắt về đã được thuần dưỡng 7 ngày tại cơ sở thực nghiệm trước khi bắt
đầu bố trí thí nghiệm với 24 con/nghiệm thức. Mô hình và cách tổ chức thí nghiệm
đã được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu (trang 25). Ở thí nghiệm đợt I đã thể hiện Fucoidan và Diệp Hạ Châu hoàn toàn không ảnh hưởng tới tỷ lệ sống và sinh trưởng của tôm thí nghiệm. Do vậy, chỉ có 1 nghiệm thức đối chứng âm (ĐC-)
được bố trí ởđợt thí nghiệm II. Thí nghiệm đợt II đã được thực hiện trong điều kiện môi trường như sau:
Độ mặn: 30%,
Nhiệt độ nước dao động trong khoảng: 28,2-310C pH nước: 7-8.
DO: sục khí liên tục 24h/ngày đêm
Trong đợt thí nghiệm thứ 2, chỉ có 1 ngày nhiệt độ nước vào buổi chiều lên tới 31oC, các thời gian còn lại nhiệt độđều nằm trong khoảng 28- 30oC. Ở nhiệt độ
này, hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng có thể bùng phát thuận lợi nếu bị cảm