Theo GS.TS Đỗ Tất Lợi, (2003), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus spp), còn có tên địa phương khác là Chó đẻ răng cưa, Diệp hòe thái, Lão nha châu thuộc họ Thầu dầu (Euphorbia ceae). Cây cao chừng 20-30cm, thân mọc thẳng đứng mang cành. Lá mọc so le, lưỡng bội trông như lá kép, phiến lá thuôn, dài 5-15mm, rộng 2-5mm,
đầu nhọn hay hơi tù, mép lá có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới màu xanh lơ, không cuống. Hoa mọc ở kẻ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, dơn tính, hoa đực và hoa cái ở cùng cành: đực ởđầu cành, cái ở cuối cành. Quả treo lủng lẳng dưới lá, đường kính quả
Hình 1.5: Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria)
Diệp hạ châu phân bố rộng, tập trung nhiều ở vùng nhiệt đới, cây mọc quanh năm, phát triển mạnh nhất vào mùa hè. Thành phần chất hóa học có trong Diệp hạ
châu đã được biết bao gồm: Phyllanthen (C24H30O6), Hyphophylllanthen
(C24H30O7), Niranthin (C24H30O6), Nirtetralen (C24H30O6), Philteralin (C24H30O6), acid Elagic, acid Egalic, một số dẫn xuất Phenolic. [8].
Trong y học hiện nay đã tồn lại các loại thuốc được sản xuất từ cây Diệp hạ
châu, như thuốc viên có tên thương mại là “Diệp Hạ Châu” được sản xuất bởi Công
ty CP Đông dược 5- PHIDOPHARM, Công Ty CP PYMEPHARCO (Dược Phú
Yên), Công ty Cổ phần Nam Dược (Cầu Giấy-Hà Nội), Công ty CP Vật tư Y Tế Hải Dương…dùng để hỗ trợ trong điều trị bệnh viêm gan và suy thận của người. Sản phẩm trà uống “Diệp hạ Châu” cũng đã và đang được bán trên thị trường nhằm chữa trị các bệnh vềđường tiêu hóa, mụn nhọt, lở ngứa và tăng chức năng gan.
Hình 1.6: Sản phẩm Diệp Hạ Châu dạng viên dùng trong y học, để hổ trợđiều trị
bệnh viêm gan siêu vi B
Các loại thuốc được sản xuất từ cây Diệp hạ châu không phải chỉ để chữa bệnh cho con người, mà những năm gần đây đã có ứng dụng dùng một số sản phẩm chế
biến từ loại thảo dược này phòng ngừa bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
Khi nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Diệp hạ châu, Direkbusarakom (1998) cho rằng, dich chiết thô của cây Chó đẻ răng cưa có tác dụng kháng khuẩn cao đối với các loài vi khuẩn thường gây bệnh ở tôm và cá nuôi, đặc biệt nó còn có tác dụng ức chế một số virus gây bệnh trên tôm. Nồng độ có hiệu quả để trị bệnh cho tôm là 5mg/ml, nồng độ sử dụng để trị bệnh nhiễm khuẩn do Aeromonas hydrophyla và Edwardiella tarda gây ra cho cá tra nuôi (Pangasius spp) là 500g khô hoặc 2-5kg tươi cho 100kg cá ăn trong 3 ngày liên tiếp, mỗi ngày một lần. [18].
Lý Thị Thanh Loan & ctv (2009) đã thực hiện đề tài nghiên cứu phòng bệnh
đốm trắng trên tôm Sú (Penaeus monodon) bằng sản phẩm Diệp Hạ Châu. Sau 5 tuần dùng thuốc, tôm ở các lô thí ghiệm cho ăn thức ăn có bổ sung Diệp Hạ Châu đã có tỷ lệ sống sót là 96% sau khi bị cảm nhiễm WSSV, trong khi đó tôm ở lô đôi chứng đã chết 100% ở ngày thứ 10 sau cảm nhiễm.[7].
Phần 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu.
- Phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản, Trường Đại học Nha Trang. - Trại thực nghiệm được thuê ở khu vực Ba Làng, Nha Trang. - Thời gian thực tập từ 1/3/2011 – 25/6/2011.
Sơđồ khối nội dung nghiên cứu
Thử nghiệm phòng hội chứng chết đỏở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) bằng các sản phẩm đã chiết rút từ thảo dược trong điều kiện thí nghiệm
Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của 2 loại sản phẩm: F, D qua tỷ lệ chết của tôm Thu mẫu và kiểm tra mẫu tôm bệnh Lưu giữ mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ - 20 0C trong tủđông sâu PCR dương tính với WSSV (+) Mô bệnh học dương tính với WSSV (+) Tuyển chọn tôm khỏe cho thí nghiệm PCR (-) với WSSV Mô bệnh học âm tính với WSSV (-) Bố trí thí nghiệm (hình 2.2 trang 25)
Thu mẫu sau thí nghiệm (ĐC+, NT1,NT2,NT3,NT4,NT5,NT6, ĐC-1) PCR với WSSV Mô bệnh học Kêt luận và đề xuất ý kiến Tỷ lệ chết của tôm thí nghiệm sau khi dùng F, D
Đánh giá ảnh hưởng của F và D lên sinh trưởng và tỷ lệ sống của tôm qua chiều dài vài tỷ lệ sống của tôm sau thí nghiệm ở các nghiệm thức: ĐC-1, ĐC-2, ĐC-3
2.2. Vật liệu nghiên cứu.
2.2.1. Mẫu tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei).
- 1 kg Tôm he chân trắng bị nhiễm hội chứng chết đỏđược thu tại một ao bệnh
ở Ninh Hòa vào đầu tháng 4/2011 và đã được bảo quản trong tủ đông sâu ở nhiệt
độ -20°C.
- Tôm he chân trắng khỏe, đã nuôi được 45 ngày ngoài ao, âm tính với WSSV bằng kỹ thuật PCR, được thu từ một ao nuôi thương phẩm ở Cam Ranh, đã được vận chuyển về trại thực nghiệm bằng phương pháp vận chuyển kín có sục oxy. Tôm này được đưa về nới thực tập có tỷ lệ sống 100% với thời gian vận chuyển 1h.
2.2.2. Các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược đã được dùng trong thí nghiệm.
- Fucoidan (ký hiệu là F) được sản xuất từ rong mơ, đây là một sản phẩm của phân viện vật lý tại Nha Trang có bản chất là một sunfalted polysaccharides. Liều sử dụng trong thí nghiệm này là 200, 400 và 600mg/kg tôm.
- Cao Diệp hạ châu (Ký hiệu là D) được sản xuất từ cây Diệp hạ châu (Phyllanthus spp), là một sản phẩm được sản xuất tại viện nghiên cứu Thủy sản II, TP. Hồ Chí Minh. Liều sử dụng trong thí nghiệm này là: 1, 2 và 3 g/kg thức ăn tôm
-Các sản phẩm thảo dược này được giữở nhiệt độ 4-6oC cho đến khi sử dụng.
2.2.3. Chuẩn bị thức ăn của tôm thí nghiệm.
- Khẩu phần thức ăn của tôm dùng trong thí nghiệm này là 6-8% khối lượng thân. - Loại thưc ăn tổng hợp A4 của hãng CP đã được sử dụng cho thí nghiệm này
- Các liều thuốc dùng trong thí nghiệm này là:
1g, 2g và 3g D/kg thức ăn tôm
200, 400 và 600mg F /kg tôm thí nghiệm
- Thức ăn, bột F, cao D được cân đúng liều bằng cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. Hòa tan từng liều thuốc vào một thể tích nước nhỏ (3-5ml), sau đó thấm dần vào lượng thức ăn tôm đã được cân, rồi đưa thức ăn này vào tủ lạnh có chế độ
không đóng băng ở 4-6oC sau 24h với mục đích làm khô thức ăn, ghi etykét vào từng lọ thức ăn dùng cho từng nghiệm thức để không bị nhầm lẫn.
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm
- Các thùng nhựa trắng 100 lít để bố trí thí nghiệm đã được sát trùng bằng chlorine liều cao, rửa lại bằng nước ngọt, phơi nắng.
- Đã sử dụng 2 bể ximăng 3 m3để chứa nước ngọt và nước mặn. - Đã sử dụng 1 máy bơm nước, 1 máu sục khí.
- Một số dụng cụ đã dùng để đo các yếu tố môi trường nước: nhiệt kế rượu, máy đo pH bằng pin, khúc xạ kế sản xuất ở Nhật.
- Đã dùng cân điện tử sản xuất tại Nhật, có độ chính xác 0,0001g để cân thuốc, thức ăn và khối lượng tôm trước và sau TN.
- Đã dùng một thước kẹp để do chiều dài tôm độ chính xác 1mm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm
Tôm đã được nuôi thuần dưỡng ởđiều kiện có sục khí, cho ăn bằng thức ăn CP trong 7-10 ngày trước khi bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm đã được bố trí trong các thùng nhựa trắng có dung tích 100 lít, 30 con/thùng (đợt thí nghiệm I) và 24 con/thùng (đợt thí nghiệm 2) đã được bố trí theo mô hình thí nghiệm (hình 2.2 trang 25)
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phòng hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong điều kiện thí nghiệm bằng các chế phẩm đã chiết rút từ thảo dược.
Tôm khỏe nuôi thuần dưỡng trong điều
kiện thí nghiệm từ 4-7 ngày Các nghiệm thức thử Diệp Hạ Châu Các nghiệm thức thử nghiệm Fucoidan Các nghiệm thức đối chứng NT1 (Dùng TA + F với 200 mg/kg tôm) NT2 (Dùng TA + F với 400 mg/kg tôm) NT4 (Dùng TA + D với 1g/ kg TA) NT5 (Dùng TA + D với 2g/ kg TA) NT6 (Dùng TA + D với 3g/ kg TA) NT3 (Dùng TA + F với 600 mg/kg tôm) ĐC+ (Dùn g TA khôn g trộn với F và D) ĐC-3 (Dùng TA có trộn với D 3 g/kg thức ăn) ĐC-2 (Dùng TA có trộn với F 600 mg/kg tôm) ĐC-1 (Dùng TA của CP) không trộn F, D)
Sau 5-7 ngày nuôi, tôm được cảm nhiễm bằng
phương pháp cho ăn xác tôm chết vì hội chứng chết
đỏ trong 12-30h
- Thí nghiệm được thực hiện 2 đợt, mỗi đợt lặp lại 2 lần; Có 24-30 con tôm/thùng 100 lít
Theo dõi một số yếu tố môi trường: nhiệt độ, độ mặn, pH hàng ngày (sáng và chiều)
- Xifon đáy 1 lần/ngày đêm; sục khí 24h/ngày
- Theo dõi tình trạng bắt mồi và các biến đổi về tập tính sống, màu sắc cơ thể và số lượng tôm chết hàng ngày - Thu các con tôm hấp hối sau cảm nhiễm ở các nghiệm thức để kiểm tra bằng kỹ thuật PCR và phương pháp mô học học.
- Đánh giá khả năng kìm hãm sự bùng phát hội chứng chết đỏ của tôm khi cho ăn thức ăn có bổ sung
Chế phẩm Fucoidan dạng bột được sản xuất từ rong mơ của phân viện vật Lý Nha Trang (liều lượng thí nghiệm: 200, 400 và 600mg/kg tôm) và chế phẩm là cao Diệp Hạ Châu được sản xuất từ cây Diệp hạ châu (Phyllanthus spp) của Viện nghiên cứu thủy sản II, thành phố Hồ Chí Minh (liều lượng: 1, 2 và 3g/kg thức ăn)
được trộn vào thức ăn tổng hợp của hãng CP đã được dùng cho tôm thí nghiệm trước và sau khi cảm nhiễm.
Có 4 nghiệm thức đối chứng trong thí nghiệm này:
- Nghiệm thức đối chứng dương (ĐC+): tôm được cho ăn thức ăn không trộn thuốc (F hoặc D) trong 4-7 ngày, sau thời gian cảm nhiễm bằng phương pháp cho ăn xác tôm bệnh trong 12h (đợt 2) -30h (đợt 1), thức ăn tổng hợp (không trộn thuốc) lại được sử dụng cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
- Nghiệm thức đối chứng âm thứ nhất (ĐC-1): thức ăn tổng hợp của hãng CP (không trộn thuốc) đã được sử dụng cho tôm ở nghiệm thức này ăn trong suốt thời gian thí nghiệm và tôm không bị cảm nhiễm.
- Nghiệm thức đối chứng âm thứ hai (ĐC-2): thức ăn tổng hợp CP đã trộn với sản phẩm Fucoidan với liều trộn 600mg/kg tôm, thức ăn đã dùng cho tôm ăn trong suốt thời gian thí nghiệm, tôm ở nghiệm thức này cũng không bị cảm nhiễm bệnh.
- Nghiệm thức đối chứng âm thứ ba (ĐC-3): thực hiện tương tự như ĐC-2, nhưng thức ăn được trộn với Diệp Hạ Châu ở nồng độ 3g/kg thức ăn thay thế cho Fucoidan.
Cảm nhiễm virus bằng phương pháp cho ăn: xác tôm bị hội chứng chết đỏ,
đã được thu ở một ao nuôi tôm thương phẩm tại Ninh Hòa, được xảđông ở nhiệt độ
phòng rồi làm thức ăn cho tôm ở các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6 (đã được biểu thịở hình 2.2 trang 25), trong thời gian 30h (đợt 1) và 12h (đợt 2). Thức ăn tổng hợp có trộn thuốc F đã được dùng cho tôm trong các nghiệm thức NT1, NT2, NT3 và trộn với sản phẩm D được dùng cho tôm trong các nghiệm thức
NT4, NT5, NT6 trước (4-7 ngày) và sau khi cảm nhiễm cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
Nghiệm thức NT1, NT2, NT3: tôm thí nghiệm được cho ăn thức ăn tổng hợp của CP, có bổ sung Fucoidan (F) lần lượt với nồng độ 200, 400 và 600 mg/ kg tôm, trước và sau khi cảm nhiễm.
Nghiệm thức NT4, NT5, NT6: tôm thí nghiệm được cho ăn thức ăn tổng hợp của CP, có bổ sung Diệp Hạ Châu (D) lần lượt với nồng độ 1, 2 và 3g/ kg thức ăn, trước và sau khi cảm nhiễm.
2.4. Phương pháp phân tích mẫu tôm.
Mẫu đại diện cho tôm bệnh, tôm khỏe thu được ngoài ao nuôi và các mẫu tôm bệnh thu được trong thí nghiệm cảm nhiễm đều được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để xác định mức độ nhiễm WSSV và bằng phương pháp mô bệnh học để xác định các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào của tôm bệnh.
2.4.1. Phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR.
Các con tôm hấp hối ở ao hay ở thí nghiệm đã được cốđịnh trong cồn 95%. Sau đó được nghiền với dd SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) 0.0025% và NaOH 0.005 N để ly trích DNA. Sau đó tiến hành phản ứng PCR theo qui trình dành cho những virus chứa ADN (tiêu chuẩn Ngành Thủy sản: 28TCN202:2004). Điện di trên gel Agarose và đọc kết quả dưới đèn cực tím, nhận biết sự hiện diện của WSSV nhờ so sánh thang DNA chuẩn cũng với mẫu đối chứng dương và âm. Kỹ thật PCR
đã được phân tích tại phòng công nghệ sinh học của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trường Đại Học Nha Trang.
2.4.2. Phương pháp mô học.
Mẫu tôm bị bệnh nhưng còn sống và mẫu tôm khỏe ở nghiệm thức đối chứng
được thu tại nơi thí nghiệm, cố định bằng dung dịch Davidson (là hỗn hợp của cồn etanol, Formalin và acid acetic). 0.5- 1 ml (CC) dung dịch cố định được tiêm vào
phần đầu ngực của mỗi con tôm, sau đó mẫu tôm này được ngâm trong dung dịch cốđịnh với tỷ lệ về thể tích là 1/10, sau 36-48h các mẫu này được chuyển sang cồn etanol 70% để bảo quản. Các tiêu bản mô bệnh học được làm theo phương pháp mô bệnh học truyền thống, áp dụng cho động vật giáp xác và đã được giới thiệu bởi Lightner, D.V, 1996. [35].
2.4.3. Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường.
Độ mặn (S‰) được xác định bằng khúc xạ kế trước và sau khi kết thúc thí nghiệm.
Nhiệt độ nước được đo hàng ngày, tại 2 thời điểm là 6h và 14h.
pH nước được đo hàng ngày bằng máy đo pH chạy pin, ở 2 thời điểm là 6h và 14h.
2.4.4. Phương pháp xác định sinh trưởng của tôm trong thí nghiệm.
Đểđánh giá ảnh hưởng của các chế phẩm Diệp Hạ Châu và Fucoidan tới tôm thí nghiệm, kích thước và khối lượng tôm trong 3 nghiệm thức đối chứng (ĐC-1,
ĐC-2 và ĐC-3) đã được cân và đo trước và sau thí nghiệm.
Chiều dài toàn thân của tôm được đo từ chớp tủy đến chớp đuôi bằng thước
đo có độ chính xác 0.1 mm. Khối lượng tôm được đo bằng cân điện tử có độ chính xác 0.1mg. Trước khi cân, tôm đã được làm khô bằng một giấy thấm.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu.
Các số liệu thu được ở các thí nghiệm được xử lý trên phần mềm SPSS 17.0 cho Window. Sử dụng phân tích phương sai Anova một yếu tốđể so sánh tỷ lệ chết tích lũy trung bình giữa các nghiệm thức của thí nghiệm với nhau và so với đối chứng.
Tỉ lệ tôm chết tích lũy được tính theo công thức:
Số tôm chốt dốn đốn mốt thối điốm Tổng số tôm đưa vào thí nghiệm
Khối lượng trung bình hoặc chiều dài trung bình của tôm được xác định theo công thức sau:
W (g) = Tổtng khối lượng tôm đem cân
ổng số con tôm đem cân L (cm) = Tổng chiTổng sều dài tôm ố con đem đđem o đo
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả dùng 2 sản phẩm Fucoidan và Diệp Hạ Châu để ngăn chặn sự
bùng phát hội chứng chết đỏ do WSSV gây ra ở tôm chân trắng (Litopennaeus vennamei).
3.1.1. Kết quả đợt thí nghiệm thứ nhất
Đợt thí nghiệm này đã bắt đầu từ ngày 23/5/2011 và kết thúc vào ngày 7/6/2011. Đàn tôm khỏe (âm tính với WSSV khi kiểm tra bằng kỹ thuật PCR) dùng cho thí nghiệm được bắt từ một ao tôm nuôi thương phẩm đã nuôi được 40 ngày, tại Cam Ranh, có khối lượng trung bình 3,14 ± 0,20g/con. Tôm này đã được thuần dưỡng 7 ngày tại cơ sở thực nghiệm trước khi bắt đầu thí nghiệm, bố trí 30 con/nghiệm thức. Mô hình và cách tổ chức thí nghiệm đã được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu (trang 25). Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện môi trường như sau: