Stt Đối tượng thử nghiệm Nguồn gốc độc tố Kết quả (Liều gây chết)
1 Vịt con 1 ngày tuổi Trích từ đậu phộng
Aflatoxin B1 : 0.36mg/kg Aflatoxin B2 : 1.69 mg/kg Aflatoxin G1 : 0.78mg/kg Aflatoxin G2 : 2.45 mg/kg 2 Phơi gà Trích từ đậu phộng Aflatoxin 0.3µg Aflatoxin B1 : 0.025 µg/ trứng Aflatoxin B2 : 0.125 µg/ trứng Aflatoxin G1 : 1.2µg/ trứng Aflatoxin G2 : 2.7µg/ trứng Aflatoxin M1 : 0.2µg/ trứng
3 Ấu trùng giáp xác (Artemia salina) Trích ly từ đậu phộng Aflatoxin B1 0.5g/ml
4 Cá vàng Brachydanio rerio Trích ly từ đậu phộng Aflatoxin B1 0.1µg/ml 5 Nòng nọc nhái Rana temporaria
Bufo melanostriclus, Racophorus leucomyslax
Uperodon sp
Trích ly từ đậu phộng
Aflatoxin trên 2µg/ml Dưới hàm lượng trên nịng nọc khơng
thể biến thành Nhái trưởng thành
Nguồn: Đặng Hồng Miên, 1980. Nấm mốc độc trong thực phẩm, NXB KHKT Hà Nội
- Một thử nghiệm độc học môi trường sử dụng hệ hơ hấp của màng ty thể tim bị của nhóm tác giả Lê Phi Nga đăng tải trên Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ tập 10 số 1- 2007 đây là nghiên cứu đầu tiên được thử nghiệm tại Việt Nam. Ở
18
nghiên cứu này, màng ty thể (SMP) chiết xuất từ tim bò dùng cho test thử độc học. Kết quả cho thấy rằng test thử SMP nhạy cảm với một số chất độc chuẩn tương tự như SMP thu được trong một số kết quả nghiên cứu đã công bố trên thế giới. Trong phạm vi nghiên cứu, phương pháp SMP cho kết quả tương đương với phương pháp Microtox, tốt hơn phương pháp Daphnia đối với chất độc hữu cơ. Với lợi thế của phương pháp là nhanh (cho kết quả thử nghiệm trong vòng 2 giờ), giá thành thấp, độ lặp lại cao, phương pháp thử nghiệm SMP nên được đưa vào sử dụng như các những phương pháp thử nghiệm độc học hiện có. Cũng giống như các thử nghiệm độc học môi trường khác, phương pháp dùng ty thể hoặc SMP của ty thể cũng có yếu điểm của nó. SMP có độ nhạy kém với ammonia, colchicin. Ngồi ra, do phép thử sử dụng phương pháp so màu cho nên mẫu có độ đục cao hoặc có màu đều gây ảnh hưởng tới tính chính xác của phép thử.
- Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Đồn Đặng Phi Cơng và đồng sự để đánh giá độc cấp tính và mãn tính của một số nước thải cơng nghiệp điển hình ở Việt Nam như dệt nhuộm, chế biến mủ cao su, sản xuất giấy, sản xuất cồn rượu và nước rỉ rác bằng trên tác nhân vi sinh vật (Vi khuẩn Photobacterium phosphoreum cung cấp bởi công ty Azur Environmental; Vi tảo: Selenastrum capricornutum cung cấp bởi Khoa Sinh - Trường Đại học tổng hợp Hull – Anh Quốc; Vi giáp xác:
Ceriodaphnia cornuta phân lập từ mẫu nước sông Đồng Nai). Kết quả thử nghiệm
EC50, LC50 của các sinh vật thử nghiệm khác nhau cho thấy độ độc của nước thải không tỉ lệ thuận với nồng độ COD mà phụ thuộc nhiều vào nồng độ BOD, ammonia, nitrite và TDS. Dựa vào kết quả nghiên cứu này có thể đề xuất giá trị giới hạn COD cho tiêu chuẩn nước thải của ngành công nghiệp cụ thể.
- Thử nghiệm coagulase bằng huyết tương thỏ đông khô sản xuất tại Viện Pasteur TP. HCM nhằm phát hiện Staphylococcus gây bệnh, quan trọng nhất Staphylococcus aureus là vi khuẩn chủ yếu gây nhiều bệnh nhiễm trùng trầm trọng
cho người như viêm da mãn tính, viêm xương khớp, áp-xe ở các vị trí sâu, nhiễm trùng vết thương, viêm phổi, viêm màng tim, viêm cơ tim, viêm màng não, nhiễm trùng huyết… có thể dẫn đến tử vong.
Ngồi ra, S. aureus cịn là tác nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm do sản xuất
độc tố ruột tác động lên hệ tiêu hóa. Đây là một test thử nghiệm dùng để phát hiện độc tố ruột có thể tồn tại trong mẫu thơng qua sản phẩm tạo thành trong quá trình phát triển của vi sinh vật, cụ thể là enzyme coagulase do vi khuẩn tạo thành trong quá trình xâm nhập và làm hư hỏng thực phẩm. Vì vậy, thử nghiệm này cũng chỉ có thể dùng để phát hiện một chất độc cụ thể và chỉ áp dụng trong trường hợp cụ thể.
19
- Một sản phẩm khác sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) để xét nghiệm nhanh vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Đó là đề tài nghiên cứu của tác giả Trần Linh Thước. Trường đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh. Vì vậy, với phương pháp PCR, chỉ cần khoảng 20 giờ là có thể tìm ra ngun nhân của một vụ ngộ độc. Điều đặc biệt là các bộ kit không chỉ gọi tên một loại vi sinh vật gây ngộ độ thực phẩm mà chúng có thể phát hiện ra 12 loại vi khuẩn khác nhau như: E.coli 0157, Salmonella spp, Shigella spp, nấm mốc… Tùy thuộc vào loại
thực phẩm và số loại chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát đối với mỗi loại thực phẩm, các quy trình, bộ kit PCR cho phép xét nghiệm và gọi tên tất cả các vi khuẩn nêu trên trong vòng 24 giờ (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian ni cấy tăng sinh dài).
Nhìn chung, kỹ thuật phát hiện độc chất dựa trên đáp ứng của chỉ thị sinh học trên thế giới đã có những bước phát triển vượt bậc. Tuy nhiên, sản phẩm bộ thử nghiệm phất hiện độc tố bằng chỉ thị sinh học với hiệu quả cao chỉ được thương mại hóa bởi các quốc gia phát triển như Hoa Kỳ, Châu Âu. Tại Việt Nam hiện nay chưa có đơn vị nào sản xuất bộ thử nghiệm độc chất thông qua chỉ thị sinh học mà chỉ dừng lại ở những nghiên cứu bước đầu ứng dụng chỉ thị sinh học trong thử nghiệm phát hiện độc tố dựa trên các kiến thức của các nhà khoa học trên thế giới. Ngoài trừ sản phẩm phát hiện enzyme coagulase bằng huyết tương thỏ và bộ thử nghiệm PCR phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh.
Chính vì thế, việc đầu tư và nghiên cứu bộ kít thử nghiệm độc chất cần được quan tâm nhiều hơn tại Việt Nam nhằm đáp ứng nhu cầu nghiên cứu trong lĩnh vực độc học. Ngoài ra, với mục tiêu nâng cao chất lượng sống của người dân và yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những tiêu chí quan trọng thì nhu cầu về một bộ công cụ nhằm phát hiện độc tố rất cần thiết.
Độc chất có thể phát hiện bởi các phương pháp phân tích khác nhau. Tuy nhiên, phương pháp phát hiện độc tố bằng sinh học có nhiều ưu điểm hơn vì những đáp ứng của sinh vật thử nghiệm mặc dù không phải lúc nào cũng tương đồng với người nhưng dù sao chúng ta cũng có cơ sở để dự đốn ảnh hưởng của độc tố đối với cơ thể con người. Chính vì thế thử nghiệm độc tố bằng sinh vật chỉ thị được các nhà khoa học quan tâm phát triển.
Quy trình thử nghiệm độc tố bằng chỉ thị sinh học thường được tiến hành các bước như sau:
20
Biểu đồ 1 Quy trình thử nghiệm độc chất bằng sinh vật chỉ thị
2.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu thử nghiệm độc tính sử dụng chỉ
thị sinh vật
2.2.1. Nguyên tắc
Tính chất độc hại (độc tính) của một tác nhân được mô tả thông qua các thông số quy định về nồng độ và tác dụng của tác nhân lên quần thể. Ví dụ nếu một nhóm cá cùng lồi, tuổi và cân nặng tiếp xúc với một nồng độ nhất định của một tác nhân trong một thời gian nhất định. Khi bắt đầu có 1 cá thể chết có nghĩa tác nhân khảo sát có khả năng độc tính gây chết. Khả năng gây chết của tác nhân có thể được đánh giá bằng cách ghi lại thời gian cần để nửa số cá chết. Nói cách khác, nồng độ (C) của tác nhân có thể gây chết 50% cá là x giờ. Như vậy, ví dụ trên cho thấy 2 nguyên tắc cơ bản trong thử nghiệm độc tính là
-Độc tính là một hàm số biểu hiện 2 yếu tố là nồng độ và thời gian
-Đối tượng sử dụng trong thử nghiệm phải có đáp ứng đối với ảnh hưởng của tác nhân
2.2.2. Thiết kế thử nghiệm
Những lưu ý trong thiết kế thử nghiệm độc tính trong nước thải -Kiểu đáp ứng của sinh vật thử nghiệm (gây chết; bất hoạt...) -Thời gian tiếp xúc (cấp tính hoặc mãn tính)
-Sinh vật sử dụng trong thử nghiệm
Mẫu cần thử nghiệm Đồng nhất mẫu Bộ thử nghiệm Chuẩn bị sinh vật Tiến hành thử nghiệm Đọc kết quả Tính tốn kết quả Kết quả
21
-Tuổi và kích thước của sinh vật thử nghiệm -Sự phù hợp của phương pháp
-Độ phức tạp và chi phí.
Khi xem xét các yếu tố liên quan cần phải trong mối liên hệ giữa các yếu tố với nhau. Yếu tố quan trọng nhất là mục đích của các bài kiểm tra là thử nghiệm nhanh chóng, đáng tin cậy và chi phí chấp nhận là những gì cần thiết. Bên cạnh đó khơng được coi nhẹ yếu tố mức độ chính xác cao (độ lặp lại kết quả) và phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế cơng nhận. Ngồi ra, các yếu tố như số lượng test thực hiện, kích thước mẫu, kích thước và khả năng sẵn sàng sử dụng của sinh vật thử nghiệm cũng đáng được quan tâm
2.2.3. Các kiểu thử nghiệm độc tính
Việc lựa chọn các kiểu thử nghiệm phụ thuộc quy định, mục tiêu, nguồn nhân lực, đặc điểm của sinh vật thử nghiệm, tác nhân gây độc trong mẫu thử nghiệm. Thử nghiệm độc tính cấp của nước thải thường được tiến hành với nhiều nồng độ khác nhau hoặc thử nghiệm xác định. Thử nghiệm bao gồm 1 mẫu đối chứng và ít nhất 5 nồng độ nước thải. Thiết kế thí nghiệm nhằm làm rõ nồng đơ gây đáp ứng đối với sinh vật thử nghiệm làm chết 50% (LC50) trong khoảng thời gian quy định (24- 96 giờ) hoặc nồng độ nước thải cao nhất sinh vật có thể chịu đựng mà khơng có sự khác biệt về mặt thống kê so với mẫu đối chứng. Kết quả âm tính từ thử nghiệm độc tính cấp tính khơng loại trừ khả năng nhiễm độc mãn tính. Ngồi ra, do sự biến đổi theo thời gian của dịng chảy độc tính của nước thải có thể thay đổi, kết quả âm tính của một mẫu cụ thể khơng loại trừ khả năng sẽ khác nếu mẫu thu thập vào một thời điểm khác
Các kiểu thử nghiệm độc tính bao gồm: Tĩnh không lập lại, tĩnh lập lại và liên tục Tĩnh không lập lại: Sinh vật thử nghiệm được tiếp xúc với tác nhân thử nghiệm tương tự trong suốt thời gian thử nghiệm
Tĩnh lập lại: Sinh vật thử nghiệm được tiếp xúc với tác nhân mới cùng nồng độ sau 24 giờ hoặc trong khoảng thời gian quy định khác. Thử nghiệm cũng có thể thiết kế bằng cách chuyển các sinh vật thử nghiệm vào buồng thử nghiệm khác, hoặc bằng cách thay thế toàn bộ hoặc một phần tác nhân thử nghiệm.
Liên tục: Tiến hành theo 2 cách (1) mẫu được bơm liên tục từ các điểm lấy mẫu trực tiếp vào hệ thống; (2) hoặc mẫu được thu thập định kỳ, được đặt trong một bể và được bơm liên tục từ bể vào hệ thống. Phương pháp này thích hợp kiểm tra thực địa
22
Bảng 2.4. Ưu và nhược điểm của các kiểu thử nghiệm
Kiểu thử nghiệm Ưu điểm Nhược điểm
Tĩnh không lập lại
Đơn giản, chi phí thấp. Hiệu quả trong xác định.
Trang thiết bị ít; thực hiện nhiều kiểm tra cùng lúc
Lượng mẫu nhỏ
DO suy giảm trong quá trình thử nghiệm.
Tổn thất chất độc thông qua bay hơi hoặc hấp phụ.
Độ nhạy thấp Tĩnh lập lại Khắc phục hiện tượng giảm
DO
Giảm thất thoát độc chất
Sinh vật thử nghiệm luôn trong trạng thái khoẻ mạnh
Lượng mẫu lớn Độ nhạy thấp
Có thể tổn thất độc chất do quá trình bay hơi hoặc phấp phụ
Liên tục Thích hợp đánh giá độc tính cấp và đặc điểm nguồn thải theo thời gian
DO được duy trì trong thử nghiệm.
Thử nghiệm với tải lượng cao. Giảm tổn thất độc tố do bay hơi, hấp phụ
Lượng mẫu và dung dịch pha loãng lớn
Thiết bị phức tạp và tốn kém Mặt bằng lớn
Người vận hành có chuyên mơn và khó thực hiện nhiều thử nghiệm cùng lúc
Nguồn: Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. US Environmental Protection Agency Office of Water. 2002
2.2.4. Các lồi sinh vật sử dụng trong thử nghiệm độc tính
Với mục đích sử dụng thử nghiệm độc tính để đánh giá việc tuân thủ các giới hạn quy định về độc tính và áp dụng rộng rãi. Vì vậy, khi lựa chọn của các loài để sử dụng cho thử nghiệm độc tính thì yếu tố bản địa khơng phải là yếu tố chính để xem xét.
Về nguyên tắc, một loại động vật có vú là cần thiết trong thử nghiệm độc tính nhưng trong mơi trường nước chúng ta cần một sinh vật thử nghiệm nhỏ, dễ dàng
23
ni cấy và có thể có phân bố phổ biến. Sinh vật thử nghiệm phải cho phép quan sát dễ dàng và rõ ràng phản ứng khi có đáp ứng (như tử vong hoặc bất động), Thời gian thử nghiệm ngắn; sinh vật tương đối nhạy cảm với nhiều loại hóa chất. Ngồi ra, cũng cần phải tiêu chuẩn và được quốc tế công nhận để đo lường mối quan hệ liều và tác dụng với loài sinh vật sử dụng. Dựa trên nguyên tắc đó có một số lồi rất phù hợp với yêu cầu trên như: Bọ nước (Daphnia magna), Cá hồi (Oncoryhnchus
mykiss), và vi khuẩn phát sáng (Vibrio fischeri)
Vậy nếu sử dụng chỉ 1 loài sinh vật thử nghiệm liệu có đánh giá được mức độ độc tính của tác nhân trong mơi trường nước hay khơng? Ngày nay để kiểm tra độc tính trong mơi trường nước các nhà khoa học và quản lý thường sử dụng 4 loài sinh vật thử nghiệm để kiểm tra bước đầu sau đó sử dụng 2 loại nhạy cảm nhất để tiến hành các thử nghiệm xác định. Tuy nhiên, với mục đích sử dụng đã nêu việc áp dụng 1 lồi sinh vật thử nghiệm có thể chấp nhận vì nhiều yếu tố liên quan
Một yếu tố cần quan tâm trong lựa chọn sinh vật thử nghiệm là thử nghiệm độc tính khơng chỉ khảo sát khả năng gây độc của tác nhân lên một loại động thực vật bản địa mà chúng ta mong muốn khảo sát tác động lên cộng đồng thủy sinh bao gồm nhiều lồi khác nhau (ví dụ như cá, động vật giáp xác, động vật thân mềm, tảo, vi khuẩn, v,v). Việc quyết định lựa chọn các loài thử nghiệm được thực hiện bởi cơ quan quản lý và sự tư vấn từ các nhà khoa học dựa trên những sinh vật đã sử dụng cụ thể
2.2.5. Lựa chọn tác nhân sinh học sử dụng làm tác nhân sinh học
Dựa vào các nghiên cứu và mực độ phổ biến của các tác nhân sinh học sử dụng trong thử nghiệm độc tính chúng ta có thể rút ra những nhận xét và trên cơ sở đó có thể lựa chọn loài sinh vật phù hợp nhất
1. Vi khuẩn:
+ Ưu điểm: Nhanh; Dễ dàng lưu trữ sinh vật dạng lạnh đơng và sẵn sàng sử dụng; Có sản phẩm thương mại hố; Đã được tiêu chuẩn hoá
+Nhược điểm: Cần thiết bị chuyên biệt để đọc kết quả sự phát triển và tồn tại của vi khuẩn phát quang; Người thao tác cần có kiến thức về vi sinh vật học
2. Tảo:
+Ưu điểm: Có sản phẩm thương mại hố; Đã được tiêu chuẩn hoá
+Nhược điểm: Thời gian dài; Quan sát khó; Người thao tác cần có kiến thức về vi sinh vật học; Chỉ sử dụng dạng đang phát triển từ ni cấy trong phịng thí nghiệm nên cần phải trang bị hệ thống ni cấy để duy trì liên tục
24
3. Động vật giáp xác
+Ưu điểm: Quan sát đáp ứng dễ dàng; Thiết bị đơn giản; Người thao tác cần phải tập huấn kiến thức; Dễ dàng lưu trữ dưới dạng ngủ và sẵn sàng sử dụng; Có sản phẩm thương mại hố; Đã được tiêu chuẩn hoá
+Nhược điểm: Thời gian dài
4. Cá:
+Ưu điểm: Quan sát đáp ứng dễ dàng; Đã được tiêu chuẩn hoá
+Nhược điểm: Thời gian dài; Thiết bị cồng kềnh chiếm nhiều diện tích; Người thao tác phải được tập huấn kiến thức
Dựa vào mục đích và yêu cầu của sản phẩm nghiên cứu nhằm giúp cơ quan chủ nguồn thải chủ động kiểm sốt ảnh hưởng chất ơ nhiễm tác động lên hệ sinh thái