Stt Bình số Tì lệ mẫu nước thải pha lỗng (%)
1 1 100%
2 2 50%
3 3 25%
4 4 12,5%
5 5 6,25%
Mẫu nước thải 1 2 3 4 5
Nước ngọt tiêu chuẩn 2 3 4 5
Bước 2, 3, 4 100ml 50ml 50ml 50ml 50ml 50ml 50ml
50ml 50ml
61
Hình 4.24. Cách tiến hành pha loãng mẫu nước thải theo dãy hàm lượng (100%; 50%; 25%; 12,5% và 6,25%)
4.3.1.7. Cung cấp thức ăn cho sinh vật thử nghiệm
Các con Daphnia non sử dụng trong thử nghiệm cần được cung cấp thực phẩm trước khi đưa vào thử nghiệm. Việc cung cấp thức ăn nhằm bảo đảm chúng có đủ khả năng tham gia q trình thử nghiệm vì trong q trình thí nghiệm chúng khơng được cung cấp thức ăn. Thực phẩm là vi tảo (Spirulina) cung cấp cho con non vào thời điểm 2 tiếng trước thử nghiệm.
Cách tiến hành:
-Lọ bột tảo Spirulina chứa trong bộ thử nghiệm sử dụng cho 10 thử nghiệm
- Nếu chỉ sử dụng 1 thử nghiệm chỉ sử dụng 1/10 lượng bột tảo chứa trong ống và hòa tan với nước ngọt tiêu chuẩn.
-Lắc đều lọ bột tảo bằng tay hay máy lắc cho đến khi quan sát thấy sự đồng nhất
-Hai giờ trước khi chuyển con non vào giếng thử nghiệm tiến hành cho ăn bằng cách đổ toàn bộ lượng thức ăn trong lọ vào đĩa petri ấp trứng đã nở thành con non.
-Khuấy nhẹ để phân bố thức ăn đồng đều trong hộp petri
4.3.1.8. Chuyển dung dịch thử nghiệm với các nồng độ khác nhau vào giếng thử nghiệm nghiệm
Để có thể đánh giá và kết quả có giá trị thống kê thử nghiệm cần tiến hành ở mỗi nồng độ độc chất và mẫu chứng ít nhất phải được lập lại 4 lần. Mỗi tấm thử nghiệm (multiwell) bao gồm 30 giếng bố trí thành 5 cột được đánh đấu theo ký tự A,B,C,D và 6 hàng đánh dấu theo số từ 1 đến 5 cho 5 nồng độ pha lỗng (như hình 5) đủ để thực hiện đồng thời một mẫu chứng và 5 nồng độ độc chất. Cột ngồi cùng tính từ bên trái qua có 6 giếng dùng để rửa sinh vật thử nghiệm trước khi cung cấp vào giếng thử nghiệm.
Cách tiến hành:
Dùng ống bóp cao su cho vào mỗi giếng 3ml dung dịch của mỗi nồng độ như hướng dẫn trong hình vẽ
-Cho vào các giếng hàng X mỗi giếng 3ml dung dịch nước ngọt tiêu chuẩn -Cho vào các giếng hàng 1 mỗi giếng 3ml dung dịch ở nồng độ C5
-Cho vào các giếng hàng 2 mỗi giếng 3ml dung dịch ở nồng độ C4 -Cho vào các giếng hàng 3 mỗi giếng 3ml dung dịch ở nồng độ C3 -Cho vào các giếng hàng 4 mỗi giếng 3ml dung dịch ở nồng độ C2 -Cho vào các giếng hàng 5 mỗi giếng 3ml dung dịch ở nồng độ C1
62
Hình 4. 11. Các bước tiến hành chuyển dung dịch thử nghiệm vào giếng thử nghiệm nghiệm
4.3.1.9. Chuyển sinh vật thử nghiệm vào giếng thử nghiệm
Lưu ý: Do Daphnia sẽ không phát triển tốt nếu bị yếu tố sức căng bề mặt tác động vì thế trong quá trình chuyển sinh vật vào giếng thử nghiệm tránh hiện tượng bọt khí xung quanh sinh vật. Có nghĩa tạo điều kiện cho sinh vật tiếp xúc với môi trường lỏng một cách hoàn toàn.
Cách tiến hành:
-Bước 1: Dùng ống bóp cao su hút 20 sinh vật thử nghiệm còn di chuyển vào giếng đầu tiên phía bên trái (giếng rửa) của Hàng có dấu hiệu X. Lưu ý cố gắng hạn chế chuyển dung dịch trong hộp lồng petri vào giếng rửa.
-Bước 2: Hút chính xác 5 sinh vật thử nghiệm từ giếng rửa vào mỗi giếng trong cùng hàng (A,B,C,D) C5 C1 Gi ng r a A X 5 4 3 2 D B C 1 N c ng t tiêu chu n
Cho vào m i gi ng hàng X 3 ml N c ng t tiêu chu n
C2 C3 C4 Cho vào các gi ng hàng 1 đ n 5 m i gi ng 3
ml dung d ch n ng đ t ng ng nh hình v
63
-Rửa ống hút trong nước ngọt tiệu chuẩn bằng cách hút vào và thải vào vật chứa chất thải vài lần cho sạch.
Lập lại các bước 1 và 2 với những hàng từ 1 đến 5
Hình 4. 12. Các bước tiến hành chuyển sinh vật vào giếng thử nghiệm
4.3.1.10. Ủ
-Phủ tấm đậy bằng nhựa lên toàn bộ tấm thử nghiệm nhằm tránh bốc hơi ẩm trong q trình
-Đặt tấm thử nghiệm trong mơi trường nhiệt độ 20- 22oC và khơng có ánh sáng (bóng tối)
43.1.11 Đọc kết quả thử nghiệm
Cách tiến hành
-Sau 24 và 48 giờ ủ, quan sát bằng mắt thường dưới nguồn sang hoặc đặt tấm thử nghiệm lên bàn kính hiển vi (vật kính 10X) để quan sát kết quả thử nghiệm.
Ghi lại số lượng con non Daphnia chết hoặc bất động và số lượng con non còn sống trong mỗi giếng. Lưu ý những con được xem là bất động là những con không thể bơi sau 15 giây quan sát kể cả trường hợp râu còn chuyển động.
-Ghi chép số liệu quan sát vào tờ giấy ghi kết quả.
-Dựa trên kết quả số con non chết và bất động ở mỗi nồng độ độc tố để tính giá trị trung bình và tỉ lệ % chất thử nghiệm gây tác động.
Trình bày của bảng ghi kế quả như sau:
Giếng rửa A
Bước 1: Dùng ống nhỏ giọt nhựa
chuyển 20 sinh vật thử nghiệm từ hộp petri vào
giếng rửa
Bước 2: Chuyển chính xác 5 sinh vật thử nghiệm từ giếng rửa vào các giếng cùng hàng
X 5 4 3 2 D B C 1
64
Bảng ghi kết quả
Tên người thực hiện thử nghiệm: Ngày thực hiện: Mẫu thử nghiệm: Sinh vật thử nghiệm: Phương pháp thử nghiệm: -Tĩnh khơng lập lại -Tĩnh có lập lại:
Dãy pha loãng mẫu thử nghiệm:
Nồng độ 1:……………. Nồng độ 2:……………. Nồng độ 3:……………. Nồng độ 4:……………. Nồng độ 5:………….. Bảng 4. 13. Kết quả thử nghiệm Mẫu chứng Nồng độ 5 Nồng độ 4 Nồng độ 3 Nồng độ 2 Nồng độ 1 Thời gian 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 A B C D Tổng /20 /20 /20 /20 /20 /20 /20 /20 /20 /20 /20 /20 % tác động Kết quả:
Nồng độ ức chế hữu hiệu 50% sau 24 giờ (24 h EC50):………………… Nồng độ ức chế hữu hiệu 50% sau 48 giờ (48 h EC50):…………………
Nồng độ gây chết 50% sau 24 giờ (24 h LC50):…………………………
Nồng độ gây chết 50% sau 40 giờ (48 h LC50):…………………………
4.3.1.12. Đáng giá thử nghiệm
Điều kiện thí nghiệm đối với mẫu chứng chỉ có giá trị khi và chỉ khi số lượng con chết và bất động trong mẫu chứng không vượt quá 10%
4.3.1.13. Tính tốn kết quả
EC50 là nồng độ ức chế hữu hiệu 50% sau thời gian thử nghiệm được tính theo tuyến tính bậc nhất của logarit phần trăm độ kìm hãm hoạt tính theo sự thay đổi nồng độ trong đó tỉ
65 lệ phần trăm kìm hãm
EC50 = [1 – (Sn / So)] * 100%) với:
-So là hệ số góc của mẫu đối chứng -Sn là hệ số góc khi có chất độc.
Độ tương đương giữa 2 phương pháp được biểu diễn mối bằng tương quan tuyến tính (y = ax + b) của nhóm trị số logarit EC50 của tất cả các mẫu thu được theo phương pháp này đối với nhóm trị số logarit EC50 của tất cả các mẫu thu được theo phương pháp kia
Liều gây chết 50% được tính theo cơng thức của Reed Muench
LD50 = AA50B ab a
Trong đó:
A là tỉ lệ phần trăm gây chết sát trên 50% B là tỉ lệ phần trăm gây chết sát dưới 50% a là nồng độ pha loãng tại A
b là nồng độ pha lỗng tại B Ví dụ:
Bảng 4. 14. Ví dụ kết quả thí nghiệm độc tính nước thải
Mẫu chứng C 6,25% C 12,5% C 25% C 50% C 100% Thời gian 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 A 0 1 0 0 2 2 3 3 5 5 5 5 B 0 0 0 0 1 2 2 4 5 5 5 5 C 0 0 1 1 2 2 3 3 5 5 5 5 D 0 0 1 1 2 2 3 3 5 5 5 5 Tổng 0/20 1/20 2/20 3/20 9/20 10/20 11/20 13/20 20/20 20/20 20/20 20/20 % chết 0 5 10 15 45 50 55 65 100 100 100 100 LD50 24 18,75% 18,75% LD50 48 13.13 13.13 Kết quả
LD50 sau 24 giờ là dung dịch nước thải với nồng độ 18,75% LD50 sau 48 giờ là dung dịch nước thải với nồng độ 13,13%
66
4.3.1.14. Xử lý chất thải sau thử nghiệm
-Sinh vật thử nghiệm được đánh giá như một tác nhân sinh học và xem xét xử lý theo tiêu chuẩn chất thải sinh học. Trước khi thải bỏ cần tiêu diệt tất cả sinh vật thử nghiệm bằng cách tiến hành nhỏ vào mỗi giếng thử nghiệm 1 giọt formal 1%.
-Dung dịch thử nghiệm sau khi đã tiêu diệt toàn bộ sinh vật thử nghiệm sẽ được thu gom và xử lý theo tiêu chuẩn chất thải phịng thí nghiệm
4.3.2. Bài thí nghiệm độc tính nước thải với Brachionus calyciflorus
4.3.2.1 Giới thiệu test và sinh vật chỉ thị
Thử nghiệm sinh trắc sàng lọc với các loài động vật giáp xác được phát triển bởi các nhóm nghiên cứu của Giáo sư Tiến sĩ G. Persoone tại Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Độc học mơi trường và sinh thái thuỷ sản thuộc Đại học Ghent Bỉ.
Hình 4. 13.Vật liệu bộ kít thử nghiệm độc tính nước thải
Bộ kít thử nghiệm độc tố chứa tồn bộ những vật liệu cần thiết để thực hiện thử nghiệm độc tính một cách đơn giản, nhanh chóng, nhạy cảm và chi phí thấp. Thử nghiệm độc tính đặc biệt phù hợp cho độc chất thường hiện diện trong nước biển.
Ưu điểm chính của bộ thử nghiệm là sinh vật thử nghiệm được đưa vào bộ dụng cụ dưới dạng bất hoạt và chúng có thể được kích hoạt khi sử dụng. Điều này giúp giảm chi phí cho
67
quá trình duy trì sinh vật thử nghiệm ln trong trạng thái hoạt động. Kích thước bộ thử nghiệm và khơng gian cần thiết để tiến hành thử nghiệm khơng lớn giúp giảm chi phí và đễ dàng thao tác đối với đơn vị sử dụng
Sinh vật sử dụng trong thử nghiệm đã được áp dụng rộng rãi để thử nghiệm độc tính là động vật giáp xác Brachionus calyciflorus sử dụng dưới dạng trứng bất hoạt (Cyst).
Những quả trứng được bảo vệ trong một lớp kén, và có thể được lưu trữ trong thời gian dài mà không bị mất khả năng tồn tại. Khi trứng bất hoạt (Cyst) được đặt vào điều kiện môi trường phù hợp sẽ phát triển trong khoảng 24 giờ và sau đó có thể được sử dụng ngay lập tức cho các thử nghiệm độc tính.
Thiết bị cần thiết là lị ấp trứng (ở 25°C), kính hiển vi (độ phóng đại 10-12 lần) và dụng cụ thủy tinh phịng thí nghiệm thơng thường
Ngun tắc thử nghiệm: Thử nghiệm dựa trên nguyên tắc tĩnh không lập lại để xác định giá trị EC50 hoặc LC50 sau 24- 48 giờ phơi nhiễm trên đối tượng sinh vật thử nghiệm là con non cùng một độ tuổi.
Trứng sinh vật thử nghiệm (Cyst) phải được lưu trữ tối ở nhiệt độ 5°C (± 2°C) để bảo đảm khả năng tồn tại.
Vật liệu bao gồm trong bộ thử nghiệm
- Trứng Rotifer dạng bất hoạt (Cyst): 1 ống nhựa 1 ml bao phủ bằng nhôm lá mỏng chứa trứng của Brachionus calyciflorus. Trứng được lưu trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5°C (±
2°C) cho đến khi sử dụng. Số lượng trứng từ mỗi lọ có khả năng tạo số con non đủ cho một thử nghiệm độc tính.
-Hố chất pha nước sử dụng trong thử nghiệm: 1 bộ hố chất mỗi bộ gồm có 7 ống nhựa để tạo thành 1 lít nước ấp trứng và pha lỗng dùng trong thử nghiệm.
Lọ 1: NaCl (26.4 g – Hòa tan trong 1 l = 26.4 g/l) Lọ 2: KCl (840 mg - Hòa tan trong 1 l. = 840 mg/l) Lọ 3:CaCl2 (1670 mg - Hòa tan trong 1 l. = 1670 mg/l) Lọ 4: MgCl2 (4600 mg - Hòa tan trong 1 l. = 4600 mg/l) Lọ 5: MgSO4 (5580 mg - Hòa tan trong 1 l. = 5580 mg/l) Lọ 6: NaHCO3 (170 mg - Hòa tan trong 1 l. = 170 mg/l) Lọ 7: H3BO3 (30 mg - Hòa tan trong 1 l. = 30 mg/l)
68
-Plate nhựa: 1 Plate nhựa có nắp mỗi plate có số giếng đủ sử dụng cho thử nghiệm độc tính nước thải
-Bột tảo Spirulina: 1 lọ nhỏ chứa bột tảo Spirulina dùng làm thức ăn cho con non trước khi thử nghiệm sau khi được ấp từ trứng.
-Ống nhỏ giọt nhựa: 1 ống nhỏ giọt nhựa sử dụng để chuyển sinh vật vào giếng thử nghiệm
-Rây nhỏ: Sử dụng rửa trứng trước khi ấp
-Giấy ghi kết quả thí nghiệm: 1 tập giấy để ghi kết quả thí nghiệm -Giấy hướng dẫn sử dụng: 1 bản
-Tất cả những vật liệu và hóa chất sử dụng được chứa trong thùng mốp
Hình 4. 14. Thùng chứa kít thử nghiệm độc tính nước thải
4.3.2.2. Chuẩn bị nước sử dụng trong thử nghiệm
Nước sử dụng trong thử nghiệm là nước biển tiêu chuẩn (The Standard Seawater) theo tiêu chuẩn ISO 6341 được tạo thành bằng cách bổ sung một số loại muối trong nước cất hoặc nước loại ion. Nước biển tiêu chuẩn được sử dụng trong quá trình ấp trứng và q trình pha lỗng mẫu
Cách tiến hành 1 lít nước biển tiêu chuẩn: -Cho 800 ml nước cất vào bình định mực 1 lít
-Tháo nắp lọ chứa NaCl chuyển tồn bộ lượng muối vào bình định mức lắc đều để hịa tan hồn tồn
69
-Lần lượt chuyển tồn bộ lượng hố chất trong những lọ cịn lại theo thứ tự KCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4 ,NaHCO3 và H3BO3 vào bình định mức
-Điền đầy bình định mức đến vạch 1000 ml với nước cất. Đậy nắp và lắc với mục đích đồng nhất. Nước biển tiêu chuẩn vừa pha có nồng độ NaCl 35 ppt và thể tích đủ để thực hiện 1 thử nghiệm sinh. Nước biển tiêu chuẩn có thể lưu trữ được vài ngày trong tủ lạnh và tránh ánh sáng. Lưu ý trước khi sử dụng phải đưa về nhiệt độ phịng
Bình chứa nước cất Bình định mức 1 L
Bước 1: Cho khoảng 800 ml nước cất vào bình định mức 1 lít
1 2 3 4 Các lọ chứa hố chất
Bình định mức 1 L
Bước 2: Cho lần lượt theo thứ tự các lọ 1,2,3,4,5,6,7 vào bình định mức. Bảo đảm tồn bộ hố chất trong các lọ thuỷ tinh được chuyển vào bình và theo thứ tự
70
Bình định mức 1 L
Bước 3: Làm đầy bình định mức đến vạch với nước cất; Đậy nắp và lắc đều để đồng nhất
Hình 4. 15. Các bước tiến hành pha dung dịch nước biển tiêu chuẩn sử dụng trong thử nghiệm thử nghiệm
Cách pha chế nước biển với các nồng độ khác nhau từ nước biển tiêu chuẩn
Bảng 4. 15. Cách chuẩn bị nước có nồng độ NaCl khác nhau từ nước biển tiêu chuẩn chuẩn
Nồng độ NaCl (ppt) Nước biển tiêu chuẩn (ml) Nước vơ khống (ml)
5 14 86 10 29 71 15 43 57 20 57 43 25 71 29 30 86 14
4.3.2.3. Lưu trữ hố chất và vật liệu sử dụng trong thí nghiệm
Tất cả vật liệu và hố chất sử dụng trong thử nghiệm đều được lưu trữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng. Lưu ý trước khi sử dụng phải đưa nước biển tiêu chuẩn về nhiệt độ phịng
4.3.2.4. Làm thống nước sử dụng trong thử nghiệm
Nước biển tiêu chuẩn sử dụng trong thử nghiệm cần phải được làm thống bằng cách sục khí ít nhất là 15 phút trước khi sử dụng. Nước đã sục khí được sử dụng cho cho q trình ấp trứng và pha loãng nước thải (độc chất).
71
4.3.2.5. Ấp sinh vật chỉ thị sử dụng trong thử nghiệm
Việc tiến hành ấp trứng cần phải thực hiện trước khi thực hiện thử nghiệm ít nhất 24 giờ với nước ấp trứng có nồng độ NaCl 20 ppt
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị 10 ml nước ấp trứng có nồng độ NaCl 20 ppt bằng cách hịa trộn 5,7ml nước biển tiêu chuẩn và 4,3ml nước cất vơ khống
-Chuyển toàn bộ trứng trong lọ chứa trứng vào hộp lồng petri 10cm bằng 0,5- 1ml nước ấp trứng vừa chuẩn bị.
- Đậy nắp hộp lồng petri và ủ 24-28h, ở nhiệt độ 25°C trong điều kiện chiếu sáng liên tục với cường độ sáng 3000- 4000 lux (Nguồn sáng đặt phía trên hộp lồng petri).
Lưu ý:
Sự phát triển phôi mất khoảng 1 ngày (24 giờ) trong điều kiện tối ưu ánh sáng. Sau 28 giờ nếu số lượng con non cịn q ít có thể duy trì thời gian ấp thêm 2 giờ. Thử nghiệm cần tối thiểu 300 con non có tuổi từ 0- 2h sẽ cho kết quả chính xác nhất. Vì thế chúng ta nên tiến hành thử nghiệm vào giờ thứ 28 kể từ lúc ủ.
72
Hình 4. 16. Các bước tiến hành ấp trứng Rotifer
Pha 10ml nước ấp trứng có nồng độ NaCl 20ppt Bước 1
Nước ấp trứng
10 ml
Đĩa petri chứa trứng