Mẫu chứng C 6,25% C 12,5% C 25% C 50% C 100% Thời gian 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 A 0 1 0 0 2 2 3 3 5 5 5 5 B 0 0 0 0 1 2 2 4 5 5 5 5 C 0 0 1 1 2 2 3 3 5 5 5 5 D 0 0 1 1 2 2 3 3 5 5 5 5 Tổng 0/20 1/20 2/20 3/20 9/20 10/20 11/20 13/20 20/20 20/20 20/20 20/20 % chết 0 5 10 15 45 50 55 65 100 100 100 100 LD50 24 18,75% 18,75% LD50 48 13.13 13.13 Kết quả
LD50 sau 24 giờ là dung dịch nước thải với nồng độ 18,75% LD50 sau 48 giờ là dung dịch nước thải với nồng độ 13,13%
66
4.3.1.14. Xử lý chất thải sau thử nghiệm
-Sinh vật thử nghiệm được đánh giá như một tác nhân sinh học và xem xét xử lý theo tiêu chuẩn chất thải sinh học. Trước khi thải bỏ cần tiêu diệt tất cả sinh vật thử nghiệm bằng cách tiến hành nhỏ vào mỗi giếng thử nghiệm 1 giọt formal 1%.
-Dung dịch thử nghiệm sau khi đã tiêu diệt toàn bộ sinh vật thử nghiệm sẽ được thu gom và xử lý theo tiêu chuẩn chất thải phịng thí nghiệm
4.3.2. Bài thí nghiệm độc tính nước thải với Brachionus calyciflorus
4.3.2.1 Giới thiệu test và sinh vật chỉ thị
Thử nghiệm sinh trắc sàng lọc với các loài động vật giáp xác được phát triển bởi các nhóm nghiên cứu của Giáo sư Tiến sĩ G. Persoone tại Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Độc học mơi trường và sinh thái thuỷ sản thuộc Đại học Ghent Bỉ.
Hình 4. 13.Vật liệu bộ kít thử nghiệm độc tính nước thải
Bộ kít thử nghiệm độc tố chứa tồn bộ những vật liệu cần thiết để thực hiện thử nghiệm độc tính một cách đơn giản, nhanh chóng, nhạy cảm và chi phí thấp. Thử nghiệm độc tính đặc biệt phù hợp cho độc chất thường hiện diện trong nước biển.
Ưu điểm chính của bộ thử nghiệm là sinh vật thử nghiệm được đưa vào bộ dụng cụ dưới dạng bất hoạt và chúng có thể được kích hoạt khi sử dụng. Điều này giúp giảm chi phí cho
67
quá trình duy trì sinh vật thử nghiệm ln trong trạng thái hoạt động. Kích thước bộ thử nghiệm và khơng gian cần thiết để tiến hành thử nghiệm khơng lớn giúp giảm chi phí và đễ dàng thao tác đối với đơn vị sử dụng
Sinh vật sử dụng trong thử nghiệm đã được áp dụng rộng rãi để thử nghiệm độc tính là động vật giáp xác Brachionus calyciflorus sử dụng dưới dạng trứng bất hoạt (Cyst).
Những quả trứng được bảo vệ trong một lớp kén, và có thể được lưu trữ trong thời gian dài mà không bị mất khả năng tồn tại. Khi trứng bất hoạt (Cyst) được đặt vào điều kiện môi trường phù hợp sẽ phát triển trong khoảng 24 giờ và sau đó có thể được sử dụng ngay lập tức cho các thử nghiệm độc tính.
Thiết bị cần thiết là lị ấp trứng (ở 25°C), kính hiển vi (độ phóng đại 10-12 lần) và dụng cụ thủy tinh phịng thí nghiệm thơng thường
Ngun tắc thử nghiệm: Thử nghiệm dựa trên nguyên tắc tĩnh không lập lại để xác định giá trị EC50 hoặc LC50 sau 24- 48 giờ phơi nhiễm trên đối tượng sinh vật thử nghiệm là con non cùng một độ tuổi.
Trứng sinh vật thử nghiệm (Cyst) phải được lưu trữ tối ở nhiệt độ 5°C (± 2°C) để bảo đảm khả năng tồn tại.
Vật liệu bao gồm trong bộ thử nghiệm
- Trứng Rotifer dạng bất hoạt (Cyst): 1 ống nhựa 1 ml bao phủ bằng nhôm lá mỏng chứa trứng của Brachionus calyciflorus. Trứng được lưu trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5°C (±
2°C) cho đến khi sử dụng. Số lượng trứng từ mỗi lọ có khả năng tạo số con non đủ cho một thử nghiệm độc tính.
-Hố chất pha nước sử dụng trong thử nghiệm: 1 bộ hố chất mỗi bộ gồm có 7 ống nhựa để tạo thành 1 lít nước ấp trứng và pha lỗng dùng trong thử nghiệm.
Lọ 1: NaCl (26.4 g – Hòa tan trong 1 l = 26.4 g/l) Lọ 2: KCl (840 mg - Hòa tan trong 1 l. = 840 mg/l) Lọ 3:CaCl2 (1670 mg - Hòa tan trong 1 l. = 1670 mg/l) Lọ 4: MgCl2 (4600 mg - Hòa tan trong 1 l. = 4600 mg/l) Lọ 5: MgSO4 (5580 mg - Hòa tan trong 1 l. = 5580 mg/l) Lọ 6: NaHCO3 (170 mg - Hòa tan trong 1 l. = 170 mg/l) Lọ 7: H3BO3 (30 mg - Hòa tan trong 1 l. = 30 mg/l)
68
-Plate nhựa: 1 Plate nhựa có nắp mỗi plate có số giếng đủ sử dụng cho thử nghiệm độc tính nước thải
-Bột tảo Spirulina: 1 lọ nhỏ chứa bột tảo Spirulina dùng làm thức ăn cho con non trước khi thử nghiệm sau khi được ấp từ trứng.
-Ống nhỏ giọt nhựa: 1 ống nhỏ giọt nhựa sử dụng để chuyển sinh vật vào giếng thử nghiệm
-Rây nhỏ: Sử dụng rửa trứng trước khi ấp
-Giấy ghi kết quả thí nghiệm: 1 tập giấy để ghi kết quả thí nghiệm -Giấy hướng dẫn sử dụng: 1 bản
-Tất cả những vật liệu và hóa chất sử dụng được chứa trong thùng mốp
Hình 4. 14. Thùng chứa kít thử nghiệm độc tính nước thải
4.3.2.2. Chuẩn bị nước sử dụng trong thử nghiệm
Nước sử dụng trong thử nghiệm là nước biển tiêu chuẩn (The Standard Seawater) theo tiêu chuẩn ISO 6341 được tạo thành bằng cách bổ sung một số loại muối trong nước cất hoặc nước loại ion. Nước biển tiêu chuẩn được sử dụng trong quá trình ấp trứng và q trình pha lỗng mẫu
Cách tiến hành 1 lít nước biển tiêu chuẩn: -Cho 800 ml nước cất vào bình định mực 1 lít
-Tháo nắp lọ chứa NaCl chuyển tồn bộ lượng muối vào bình định mức lắc đều để hịa tan hồn tồn
69
-Lần lượt chuyển tồn bộ lượng hố chất trong những lọ cịn lại theo thứ tự KCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4 ,NaHCO3 và H3BO3 vào bình định mức
-Điền đầy bình định mức đến vạch 1000 ml với nước cất. Đậy nắp và lắc với mục đích đồng nhất. Nước biển tiêu chuẩn vừa pha có nồng độ NaCl 35 ppt và thể tích đủ để thực hiện 1 thử nghiệm sinh. Nước biển tiêu chuẩn có thể lưu trữ được vài ngày trong tủ lạnh và tránh ánh sáng. Lưu ý trước khi sử dụng phải đưa về nhiệt độ phịng
Bình chứa nước cất Bình định mức 1 L
Bước 1: Cho khoảng 800 ml nước cất vào bình định mức 1 lít
1 2 3 4 Các lọ chứa hố chất
Bình định mức 1 L
Bước 2: Cho lần lượt theo thứ tự các lọ 1,2,3,4,5,6,7 vào bình định mức. Bảo đảm tồn bộ hố chất trong các lọ thuỷ tinh được chuyển vào bình và theo thứ tự
70
Bình định mức 1 L
Bước 3: Làm đầy bình định mức đến vạch với nước cất; Đậy nắp và lắc đều để đồng nhất