M Ở ĐẦU
3.5.2. Chuyển đổi nitơ đánh dấu trong mẫu về dạng NH4+-N
3.5.2.1. Nitơ tổng số
Lựa chọn quy trình chuyển đổi nitơ đánh dấu về dạng NH4+ phụ thuộc vào dạng nitơ cần chuyển đổi và sự cần thiết xác định các tỉ số đồng vị nitơ riêng biệt khi có mặt nhiều dạng nitơ hay không. Việc xác định nitơ tổng số trong đất và các vật liệu không đồng nhất khác có chứa các dạng nitơ khác nhau luôn gặp nhiều
khó khăn, phức tạp do sự hiểu biết không đầy đủ về các dạng nitơ có mặt cũng như vì hàm lượng nitơ thấp trong vật liệu nghiên cứu.
Trong đất 95-99% nitơ ở dạng hữu cơ, chỉ có 1-5% ở dạng vô cơ (NH4+, NO2- và NO3-). Trong lớp đất cày 40-50% ở dạng axit amin. Nitơ trong đất và tổng số chất hữu cơ có mối tương quan rất chặt chẽ. Tỉ lệ C/N thay đổi tùy theo chất lượng chất hữu cơ, mức độ phong hóa và rửa trôi. Thường nitơ chiếm từ 5-10% tổng số
chất hữu cơ.
Đất Việt Nam có tổng số chất hữu cơ thấp so với vùng đất ôn đới nên hàm lượng nitơ tổng số và dễ tiêu trong đất nhìn chung thấp. Nitơ tổng số trong đất Việt Nam thường không quá 0,3% đối với đất đồi núi và không quá 0,2% đối với đất
đồng bằng[2].
Phá mẫu bằng axit theo quy trình Kjeldahl hay một dạng cải biên của quy trình này được sử dụng rộng rãi khi không cần phân biệt các dạng nitơ và khi không có quy trình thích hợp có thể phân biệt các dạng nitơ. Bên cạnh đó, phương pháp phá mẫu khô theo quy trình Dumas cũng được ứng dụng. Phương pháp Kjeldahl (1883), về bản chất là quy trình oxi hóa ướt và phương pháp Dumas (1831) về cơ
bản là kỹ thuật oxi hóa khô (đốt cháy).
Trong phương pháp Kjeldahl, nitơ hữu cơ trong mẫu được chuyển về dạng NH4+ do sự phân hủy bởi axit H2SO4đậm đặc với sự có mặt của các chất xúc tác nhằm thúc đẩy quá trình chuyển đổi này. Lượng NH4+ được xác định thông qua việc xác định lượng NH3 giải phóng trong quá trình chưng cất hỗn hợp sau khi phá mẫu với dung dịch kiềm mạnh. Trong quy trình Kjeldahl nguyên thủy, người ta chỉ sử dụng một mình H2SO4 trong quá trình phá mẫu, KMnO4được sử dụng để
oxi hóa hoàn toàn các phần tử hữu cơ. Tuy nhiên rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng cả tốc độ lẫn hiệu suất chuyển đổi từ nitơ hữu cơ thành nitơ ở dạng NH4+ bởi phép phân hủy với H2SO4 có thể được gia tăng bằng cách thêm vào các muối để tăng nhiệt độ của quá trình phân hủy hay chất xúc tác để thúc đẩy quá trình oxi hóa các phần tử hữu cơ. Thực tế trong các phương pháp Kjeldahl hiện nay đang được sử dụng, K2SO4 hay Na2SO4 được sử dụng để tăng nhiệt độ của
quá trình phân hủy và các chất xúc tác như Se, Hg hay Cu được sử dụng để thúc
đẩy quá trình oxi hóa các phần tử hữu cơ, đảm bảo tất cả các dạng nitơ trong mẫu
được chuyển hết về dạng NH4+.
Trong phương pháp Dumas cổ điển dùng xác định N tổng số, mẫu được nung nóng với CuO tại nhiệt độ cao (thông thường trên 600oC) trong dòng CO2 tinh khiết, và các khí giải phóng ra được dẫn trên Cu nóng để khử các khí nitơ (chủ
yếu là N2O) thành N2, và sau đó qua CuO chuyển CO thành CO2. Hỗn hợp chứa N2-CO2 được thu gom trong máy đo nitơ có chứa kiềm đậm đặc và thể tích khí N2được đo.
Đã có rất nhiều công trình báo cáo về phương pháp xác định nitơ tổng số theo quy trình Kjeldahl. Quy trình Kjeldahl sử dụng cho phép xác định nitơ tổng số
trước khi xác định tỉ số đồng vị nitơ được dựa trên các công trình của Rittenberg (1948), Sprinson và Rittenberg (1948), Glascock (1954) và Francis cùng các cộng sự (1954) và được thảo luận, cải biên bởi Bremner (1965). Giai đoạn chuyển đổi các dạng nitơ trong mẫu đất về dạng NH4+ là bước đầu tiên trong quy trình phân tích đồng vị15N. Quy trình Kjeldahl là một bước xử lý mẫu trong phép phân tích tỉ số đồng vị nitơ và hoàn toàn không có gì khác biệt với quy trình Kjeldahl sử dụng cho mẫu không đánh dấu.
Các phương pháp Kjeldahl thông thường không bao gồm lượng NO3--N, NO2--N,
được sử dụng khi phân tích nitơ tổng số trong các mẫu đất có hàm lượng NO3--N, NO2--N thấp. Các phương pháp này cần được cải biên để xác định các dạng này trong đất chứa lượng NO3-, NO2- đáng kể.
Do đất Việt Nam có độ pH thấp, Al3+ lớn, độ no kiềm thấp nên quá trình nitrat hóa trong đất tiến triển chậm chạp. Mặt khác anion này có khả năng được hấp phụ kém, dễ rửa trôi nên hàm lượng NO2- và NO3- trong đất rất thấp, hầu như
không đáng kể so với nitơ tổng số. Quá trình amôn hóa thường diễn ra mạnh hơn nitrat hóa, N dễ tiêu được hình thành chủ yếu dưới dạng NH4+,nhất là trong đất
Khảo sát hàm lượng NO2- và NO3- trong một số mẫu đất tại khu vực nghiên cứu cho thấy hàm lượng N dạng NO2- và NO3- thấp, dao động từ 0,00017% đến 0,00086% (kết quả chi tiết được thống kê trong phụ lục 7, trang 90). Lượng N dạng NO2- và NO3- này là không đáng kể so với nitơ tổng số, chiếm 0,31 đến 0,61 % lượng N tổng số trong các mẫu đất.
Bên cạnh đó, tại khu vực nghiên cứu, người dân trồng rau thường sử dụng phân hóa học N-P-K bón cho cây trồng, trong đó dạng phân nitơ thường được sử dụng là phân urê. Phân nitơ đánh dấu với đồng vị 15N sử dụng trong nghiên cứu này cũng là phân urê làm giàu 15N. Do đó có thể bỏ qua dạng NO2- và NO3- trong mẫu và sử dụng phương pháp Kjeldahl thông thường khi tiến hành phân tích nitơ tổng số trong các mẫu đất.
3.5.2.2. Nguyên lý của phương pháp Kjeldahl
Phương pháp Kjeldahl dùng xác định nitơ tổng số gồm hai giai đoạn:
i) Phá mẫu để chuyển đổi tất cả các dạng nitơ hữu cơ trong đất về dạng NH4+ ii) Xác định lượng NH4+ trong mẫu đã phân hủy
Giai đoạn phá mẫu được thực hiện nhờ quá trình đun nóng mẫu với axit H2SO4
cùng chất xúc tác nhằm thúc đẩy quá trình oxi hóa các phần tử hữu cơ và chuyển
đổi nitơ dạng hữu cơ sang dạng NH4+. Các muối thường sử dụng là K2SO4 hay Na2SO4 nhằm tăng nhiệt độ của quá trình phá mẫu và các chất xúc tác như Cu, Hg hay Se nhằm tăng tốc độ oxi hóa các phần tử nitơ hữu cơ bởi H2SO4. Lượng NH4+ trong mẫu sau khi phân hủy được xác định bằng cách thu NH3 giải phóng từ mẫu bằng phương pháp chưng cất và xác định lượng NH4+ thu gom được bằng phương pháp chuẩn độ.
Phá mẫu:
Thông số quan trọng nhất trong quá trình phá mẫu là nhiệt độ của quá trình xử lý với H2SO4, được kiểm soát chủ yếu bởi lượng K2SO4 hay Na2SO4 sử dụng. Nếu hàm lượng K2SO4 thấp (chẳng hạn 0,3g/ml H2SO4) thì thời gian phá mẫu sẽ phải kéo dài trong nhiều giờ để đạt được kết quả chính xác, nếu hàm lượng này cao (chẳng hạn 1,0g/ml H2SO4) thì thời gian phá mẫu sẽ rút ngắn một cách tương
xứng. Chất xúc tác có hiệu ứng thúc đẩy tốc độ quá trình phân hủy khi sử dụng lượng K2SO4 thấp, còn khi sử dụng lượng muối này cao, chất xúc tác không còn
đóng vai trò tăng tốc cho quá trình phân hủy. Mặc dù sử dụng hàm lượng K2SO4
cao có thể rút ngắn thời gian phá mẫu cũng như không cần sử dụng chất xúc tác, nhưng lại dẫn đến một số rắc rối như hỗn hợp thu được sau khi phá mẫu trở nên
đông đặc khi để nguội và cần thiết phải đun nóng lại với nước trước khi chưng cất với kiềm. Phá mẫu theo phương pháp Kjeldahl sử dụng nhiều hơn 0,8g muối/ml H2SO4 thường dẫn đến hiện tượng này. Và khi thêm nước đun lại sẽ gặp phải vấn đề mẫu bị văng bắn mạnh, cho dù cả khi lắc đều mẫu và đôi khi dẫn đến nứt vỡ bình đun cũng như mất mẫu. Hơn nữa khi sử dụng hàm lượng K2SO4 cao thường dẫn đến sự tạo bọt trong quá trình phân hủy và do đó trên thực tế tuy rút ngắn thời gian phân hủy mẫu nhưng thời gian để mẫu hết bọt lại kéo dài lâu hơn. Nhược điểm chính của việc sử dụng hàm lượng K2SO4 cao là dẫn đến sự mất mát nitơ trong thời gian phân hủy mẫu. Sự mất mát này xảy ra khi nhiệt độ của quá trình phân hủy vượt quá 400oC và nhiệt độ này đạt được khi sử dụng hàm lượng K2SO4 khoảng 1,3g đến 1,4g/ml H2SO4. Hàm lượng này cao hơn rất nhiều so với hàm lượng thường sử dụng trong quy trình Kjeldahl ứng dụng cho mẫu đất (0,22- 0,33g/ml H2SO4) và cao hơn mức hàm lượng cần thiết để phân hủy các hợp chất nitơ chịu nhiệt như tryptophan hay axit nicotinic (1,0g K2SO4/ml H2SO4). Sự mất mát H2SO4 trong quá trình phân hủy mẫu cũng dẫn đến sự gia tăng hàm lượng muối và nhiệt độ của quá trình. Trong điều kiện bình thường, sự mất mát do hiện tượng bay hơi và phân ly do nhiệt là rất nhỏ khi sử dụng hệ phân hủy mẫu thích hợp, chủ yếu là lượng H2SO4 tác dụng để oxi hóa các thành phần hữu cơ trong
đất và tác dụng với các thành phần khoáng hóa. Tính toán hợp lý lượng H2SO4 sử
dụng kết hợp ứng dụng hàm lượng K2SO4 thấp giúp tránh được hiện tượng mất mát nitơ do nhiệt độ quá cao trong giai đoạn phá mẫu.
Trong quy trình Kjeldahl, chất xúc tác thường sử dụng nhất là những chất có chứa Se, Hg và Cu. Hiệu quả tăng tốc giai đoạn phân hủy đất giảm dần theo thứ
hủy mẫu gần như tương đương và hiệu quả hơn rất nhiều so với Cu. Đã có những báo cáo lo lắng về sự mất mát nitơ trong quá trình phân hủy mẫu khi sử dụng Se làm chất xúc tác, tuy nhiên các nghiên cứu đánh giá đã chỉ ra rằng sử dụng Se với lượng hợp lý là an toàn và hiệu quả. Hiện tượng mất nitơ chỉ xảy ra khi sử dụng quá nhiều Se hay quá nhiều K2SO4 hay Na2SO4 và khi quá trình phân hủy mẫu kéo dài quá lâu. Công trình của Bremner (1960) đã báo cáo về các kết luận này và chỉ ra rằng không có sự mất mát nitơ xảy ra khi phá mẫu đất theo phương pháp Kjeldahl khi sử dụng Se làm chất xúc tác với lượng thích hợp ngay cả khi thời gian phá mẫu kéo dài đến 12 giờ.
Mặc dù Hg là một chất xúc tác hiệu quả trong quy trình Kjeldahl, tuy nhiên khi hỗn hợp sau phân hủy đem tác dụng với kiềm ở giai đoạn chưng cất, sự có mặt của Hg sẽ dẫn đến sự hình thành phức Hg-NH4+ và NH4+ trong phức này không
được giải phóng khi chưng cất với kiềm. Để tránh sự hình thành phức này cần khử HgO và công đoạn này gặp rất nhiều khó khăn. Bên cạnh đó, Hg là chất có
độc tính cao, chính vì vậy không nên dùng Hg làm chất xúc tác trong quy trình phân hủy mẫu đất bằng phương pháp Kjeldahl.
Hỗn hợp chất xúc tác được sử dụng trong quy trình phân hủy mẫu đất bằng phương pháp Kjeldahl thường là hỗn hợp Wieninger, gồm Na2SO4, CuSO4 và Se theo tỉ lệ tương ứng là 500 : 8 : 8. Lượng xúc tác sử dụng từ 0,7-1,4g tùy thuộc vào hàm lượng nitơ tổng số trong mẫu đất. Các mẫu đất trong nghiên cứu này thuộc nhóm đất xám bạc màu, hàm lượng nitơ tổng số thấp, lượng xúc tác lựa chọn sử dụng là 0,8g hỗn hợp xúc tác cho một gam mẫu đất.
Thời gian phân hủy mẫu cũng là một yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất của quá trình. Với thời gian phân hủy ít hơn 2 giờ, hiệu suất thu hồi tính được là nhỏ hơn 98%. Chính vì vậy quá trình phân hủy cần được kiểm soát nhiệt thật tốt và kéo dài hơn 2 giờ. Bremner trong công trình của mình đã đề nghị phân hủy mẫu đất bằng phương pháp Kjeldahl nên kéo dài trong 5 giờ để đảm bảo tất cả các dạng nitơ trong mẫu đếu được chuyển về dạng NH4+-N. Thời gian phân hủy áp dụng trong nghiên cứu này là 5 giờ.
Xác định hàm lượng NH4+-N trong dung dịch mẫu thu được:
NH4+-N trong dung dịch mẫu sau khi phân hủy bằng phương pháp Kjeldahl được giải phóng dưới dạng NH3 thông qua giai đoạn chưng cất hơi khi cho mẫu thu
được sau phân hủy tác dụng với dung dịch kiềm mạnh, NH3 giải phóng được thu gom bằng một lượng chính xác axit chuẩn (H3BO3 hoặc HCl). Khi sử dụng H3BO3 là dung dịch thu gom, lượng NH3 giải phóng được xác định thông qua phép chuẩn độ trực tiếp với dung dịch HCl. Khi sử dụng dung dịch HCl thu gom, lượng NH3 giải phóng được xác định thông qua phép chuẩn độ ngược lượng axit HCl dư bằng dung dịch NaOH chuẩn.
Các phương trình phản ứng xảy ra trong giai đoạn này:
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O Trường hợp thu gom NH3 bằng H3BO3:
NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3- H2BO3- + HCl H3BO3 + Cl- Trường hợp thu gom NH3 bằng HCl:
NH3 + HCl NH4Cl + HCldư
HCldư + NaOH NaCl + H2O
Khi mẫu sau phân hủy không chỉ dùng để xác định nitơ tổng số trong mẫu mà còn để xác định tỉ số đồng vị 15N/14N trên khối phổ hay máy quang phổ phát xạ, sử dụng axit boric sẽ dẫn đến những khó khăn và trong một số trường hợp có hiện tượng gây nhiễu. Vì vậy, trong nghiên cứu này HCl được sử dụng làm chất thu gom NH3 giải phóng từ giai đoạn chưng cất, HCl dư sau đó được xác định qua phép chuẩn độ với dung dịch chuẩn NaOH 0,02N.
Mẫu sau khi phân hủy được cho tác dụng với dung dịch NaOH 50%. Lượng NaOH này phải đảm bảo đủ dư để có môi trường kiềm mạnh, thường lượng NaOH được đề nghị sử dụng khoảng hơn gấp 3 lần lượng axit H2SO4 dùng phá mẫu. Trong nghiên cứu này, lượng NaOH 50% sử dụng là 18mL. Thao tác thêm NaOH vào mẫu cần lưu ý thực hiện chậm, cẩn thận và chỉ thực hiện khi toàn bộ
ngay khi dung dịch chuyển sang môi trường kiềm. Đầu ống ngưng của hệ chưng cất cần nhúng ngập trong dung dịch axit ở bình thu gom để tránh mất NH3.
Dung dịch trong bình thu gom là axit HCl 0,02N và chỉ thị màu methyl red- bromocresol green. Lượng HCl đã được tính toán để sau khi tác dụng hết với lượng NH3 giải phóng ra vẫn còn axit dư là 10mL. Chỉ thị methyl red- bromocresol green có khoảng đổi màu ở pH 4,5 – 5,2 chuyển từ màu hồng sang màu lục với màu trung gian là không màu dễ nhận biết bằng mắt thường. Thời gian chưng cất phụ thuộc vào kích thước hệ chưng cất và lượng mẫu chưng cất. Trong nghiên cứu này thời gian chưng cất cho một mẫu là 15 phút, lượng dung dịch mẫu thu gom vào khoảng 40mL.
Để tránh mất mát nitơ trong phép phân tích tỉ số đồng vị 14N/15N sau đó, dung dịch mẫu cần được axit hóa với HCl ngay sau khi chuẩn độ.
3.5.3. Chuyển đổi NH4+ sang khí nitơ N2
Có một số dạng nitơ nhất định có thể chuyển đổi trực tiếp sang khí nitơ thông qua phản ứng với hóa chất thích hợp. Ví dụ khí N2 là sản phẩm chính trong phản ứng giữa NH4+-N hay urê-N với hypobromit của kim loại kiềm, giữa NH4+-N hay urê- N với axit sulfamic, và giữa amit-N hay amin-N với axit nitrơ (HNO2). Trong phản ứng với axit nitrơ, một lượng đáng kể các oxit nitơ được tạo thành và một phần NO bị loại bỏ trước khi tiến hành phân tích thành phần đồng vị trong khí N2 thu được vì sự có mặt của chúng là nguồn sai số tiềm ẩn đối với các mẫu có hàm lượng gần với hàm lượng đồng vị 15N thấp. Phản ứng thường dùng để chuyển đổi về dạng khí N2 trong phép phân tích đồng vị 15N bằng khối phổ hay máy quang phổ phát xạ là phản ứng giữa NH4+-N và natri hypobromit (NaOBr).