M Ở ĐẦU
3.5.2.2.Nguyên lý của phương pháp Kjeldahl
Phương pháp Kjeldahl dùng xác định nitơ tổng số gồm hai giai đoạn:
i) Phá mẫu để chuyển đổi tất cả các dạng nitơ hữu cơ trong đất về dạng NH4+ ii) Xác định lượng NH4+ trong mẫu đã phân hủy
Giai đoạn phá mẫu được thực hiện nhờ quá trình đun nóng mẫu với axit H2SO4
cùng chất xúc tác nhằm thúc đẩy quá trình oxi hóa các phần tử hữu cơ và chuyển
đổi nitơ dạng hữu cơ sang dạng NH4+. Các muối thường sử dụng là K2SO4 hay Na2SO4 nhằm tăng nhiệt độ của quá trình phá mẫu và các chất xúc tác như Cu, Hg hay Se nhằm tăng tốc độ oxi hóa các phần tử nitơ hữu cơ bởi H2SO4. Lượng NH4+ trong mẫu sau khi phân hủy được xác định bằng cách thu NH3 giải phóng từ mẫu bằng phương pháp chưng cất và xác định lượng NH4+ thu gom được bằng phương pháp chuẩn độ.
Phá mẫu:
Thông số quan trọng nhất trong quá trình phá mẫu là nhiệt độ của quá trình xử lý với H2SO4, được kiểm soát chủ yếu bởi lượng K2SO4 hay Na2SO4 sử dụng. Nếu hàm lượng K2SO4 thấp (chẳng hạn 0,3g/ml H2SO4) thì thời gian phá mẫu sẽ phải kéo dài trong nhiều giờ để đạt được kết quả chính xác, nếu hàm lượng này cao (chẳng hạn 1,0g/ml H2SO4) thì thời gian phá mẫu sẽ rút ngắn một cách tương
xứng. Chất xúc tác có hiệu ứng thúc đẩy tốc độ quá trình phân hủy khi sử dụng lượng K2SO4 thấp, còn khi sử dụng lượng muối này cao, chất xúc tác không còn
đóng vai trò tăng tốc cho quá trình phân hủy. Mặc dù sử dụng hàm lượng K2SO4
cao có thể rút ngắn thời gian phá mẫu cũng như không cần sử dụng chất xúc tác, nhưng lại dẫn đến một số rắc rối như hỗn hợp thu được sau khi phá mẫu trở nên
đông đặc khi để nguội và cần thiết phải đun nóng lại với nước trước khi chưng cất với kiềm. Phá mẫu theo phương pháp Kjeldahl sử dụng nhiều hơn 0,8g muối/ml H2SO4 thường dẫn đến hiện tượng này. Và khi thêm nước đun lại sẽ gặp phải vấn đề mẫu bị văng bắn mạnh, cho dù cả khi lắc đều mẫu và đôi khi dẫn đến nứt vỡ bình đun cũng như mất mẫu. Hơn nữa khi sử dụng hàm lượng K2SO4 cao thường dẫn đến sự tạo bọt trong quá trình phân hủy và do đó trên thực tế tuy rút ngắn thời gian phân hủy mẫu nhưng thời gian để mẫu hết bọt lại kéo dài lâu hơn. Nhược điểm chính của việc sử dụng hàm lượng K2SO4 cao là dẫn đến sự mất mát nitơ trong thời gian phân hủy mẫu. Sự mất mát này xảy ra khi nhiệt độ của quá trình phân hủy vượt quá 400oC và nhiệt độ này đạt được khi sử dụng hàm lượng K2SO4 khoảng 1,3g đến 1,4g/ml H2SO4. Hàm lượng này cao hơn rất nhiều so với hàm lượng thường sử dụng trong quy trình Kjeldahl ứng dụng cho mẫu đất (0,22- 0,33g/ml H2SO4) và cao hơn mức hàm lượng cần thiết để phân hủy các hợp chất nitơ chịu nhiệt như tryptophan hay axit nicotinic (1,0g K2SO4/ml H2SO4). Sự mất mát H2SO4 trong quá trình phân hủy mẫu cũng dẫn đến sự gia tăng hàm lượng muối và nhiệt độ của quá trình. Trong điều kiện bình thường, sự mất mát do hiện tượng bay hơi và phân ly do nhiệt là rất nhỏ khi sử dụng hệ phân hủy mẫu thích hợp, chủ yếu là lượng H2SO4 tác dụng để oxi hóa các thành phần hữu cơ trong
đất và tác dụng với các thành phần khoáng hóa. Tính toán hợp lý lượng H2SO4 sử
dụng kết hợp ứng dụng hàm lượng K2SO4 thấp giúp tránh được hiện tượng mất mát nitơ do nhiệt độ quá cao trong giai đoạn phá mẫu.
Trong quy trình Kjeldahl, chất xúc tác thường sử dụng nhất là những chất có chứa Se, Hg và Cu. Hiệu quả tăng tốc giai đoạn phân hủy đất giảm dần theo thứ
hủy mẫu gần như tương đương và hiệu quả hơn rất nhiều so với Cu. Đã có những báo cáo lo lắng về sự mất mát nitơ trong quá trình phân hủy mẫu khi sử dụng Se làm chất xúc tác, tuy nhiên các nghiên cứu đánh giá đã chỉ ra rằng sử dụng Se với lượng hợp lý là an toàn và hiệu quả. Hiện tượng mất nitơ chỉ xảy ra khi sử dụng quá nhiều Se hay quá nhiều K2SO4 hay Na2SO4 và khi quá trình phân hủy mẫu kéo dài quá lâu. Công trình của Bremner (1960) đã báo cáo về các kết luận này và chỉ ra rằng không có sự mất mát nitơ xảy ra khi phá mẫu đất theo phương pháp Kjeldahl khi sử dụng Se làm chất xúc tác với lượng thích hợp ngay cả khi thời gian phá mẫu kéo dài đến 12 giờ.
Mặc dù Hg là một chất xúc tác hiệu quả trong quy trình Kjeldahl, tuy nhiên khi hỗn hợp sau phân hủy đem tác dụng với kiềm ở giai đoạn chưng cất, sự có mặt của Hg sẽ dẫn đến sự hình thành phức Hg-NH4+ và NH4+ trong phức này không
được giải phóng khi chưng cất với kiềm. Để tránh sự hình thành phức này cần khử HgO và công đoạn này gặp rất nhiều khó khăn. Bên cạnh đó, Hg là chất có
độc tính cao, chính vì vậy không nên dùng Hg làm chất xúc tác trong quy trình phân hủy mẫu đất bằng phương pháp Kjeldahl.
Hỗn hợp chất xúc tác được sử dụng trong quy trình phân hủy mẫu đất bằng phương pháp Kjeldahl thường là hỗn hợp Wieninger, gồm Na2SO4, CuSO4 và Se theo tỉ lệ tương ứng là 500 : 8 : 8. Lượng xúc tác sử dụng từ 0,7-1,4g tùy thuộc vào hàm lượng nitơ tổng số trong mẫu đất. Các mẫu đất trong nghiên cứu này thuộc nhóm đất xám bạc màu, hàm lượng nitơ tổng số thấp, lượng xúc tác lựa chọn sử dụng là 0,8g hỗn hợp xúc tác cho một gam mẫu đất.
Thời gian phân hủy mẫu cũng là một yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất của quá trình. Với thời gian phân hủy ít hơn 2 giờ, hiệu suất thu hồi tính được là nhỏ hơn 98%. Chính vì vậy quá trình phân hủy cần được kiểm soát nhiệt thật tốt và kéo dài hơn 2 giờ. Bremner trong công trình của mình đã đề nghị phân hủy mẫu đất bằng phương pháp Kjeldahl nên kéo dài trong 5 giờ để đảm bảo tất cả các dạng nitơ trong mẫu đếu được chuyển về dạng NH4+-N. Thời gian phân hủy áp dụng trong nghiên cứu này là 5 giờ.
Xác định hàm lượng NH4+-N trong dung dịch mẫu thu được:
NH4+-N trong dung dịch mẫu sau khi phân hủy bằng phương pháp Kjeldahl được giải phóng dưới dạng NH3 thông qua giai đoạn chưng cất hơi khi cho mẫu thu
được sau phân hủy tác dụng với dung dịch kiềm mạnh, NH3 giải phóng được thu gom bằng một lượng chính xác axit chuẩn (H3BO3 hoặc HCl). Khi sử dụng H3BO3 là dung dịch thu gom, lượng NH3 giải phóng được xác định thông qua phép chuẩn độ trực tiếp với dung dịch HCl. Khi sử dụng dung dịch HCl thu gom, lượng NH3 giải phóng được xác định thông qua phép chuẩn độ ngược lượng axit HCl dư bằng dung dịch NaOH chuẩn.
Các phương trình phản ứng xảy ra trong giai đoạn này:
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O Trường hợp thu gom NH3 bằng H3BO3:
NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3- H2BO3- + HCl H3BO3 + Cl- Trường hợp thu gom NH3 bằng HCl:
NH3 + HCl NH4Cl + HCldư
HCldư + NaOH NaCl + H2O
Khi mẫu sau phân hủy không chỉ dùng để xác định nitơ tổng số trong mẫu mà còn để xác định tỉ số đồng vị 15N/14N trên khối phổ hay máy quang phổ phát xạ, sử dụng axit boric sẽ dẫn đến những khó khăn và trong một số trường hợp có hiện tượng gây nhiễu. Vì vậy, trong nghiên cứu này HCl được sử dụng làm chất thu gom NH3 giải phóng từ giai đoạn chưng cất, HCl dư sau đó được xác định qua phép chuẩn độ với dung dịch chuẩn NaOH 0,02N.
Mẫu sau khi phân hủy được cho tác dụng với dung dịch NaOH 50%. Lượng NaOH này phải đảm bảo đủ dư để có môi trường kiềm mạnh, thường lượng NaOH được đề nghị sử dụng khoảng hơn gấp 3 lần lượng axit H2SO4 dùng phá mẫu. Trong nghiên cứu này, lượng NaOH 50% sử dụng là 18mL. Thao tác thêm NaOH vào mẫu cần lưu ý thực hiện chậm, cẩn thận và chỉ thực hiện khi toàn bộ
ngay khi dung dịch chuyển sang môi trường kiềm. Đầu ống ngưng của hệ chưng cất cần nhúng ngập trong dung dịch axit ở bình thu gom để tránh mất NH3. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch trong bình thu gom là axit HCl 0,02N và chỉ thị màu methyl red- bromocresol green. Lượng HCl đã được tính toán để sau khi tác dụng hết với lượng NH3 giải phóng ra vẫn còn axit dư là 10mL. Chỉ thị methyl red- bromocresol green có khoảng đổi màu ở pH 4,5 – 5,2 chuyển từ màu hồng sang màu lục với màu trung gian là không màu dễ nhận biết bằng mắt thường. Thời gian chưng cất phụ thuộc vào kích thước hệ chưng cất và lượng mẫu chưng cất. Trong nghiên cứu này thời gian chưng cất cho một mẫu là 15 phút, lượng dung dịch mẫu thu gom vào khoảng 40mL.
Để tránh mất mát nitơ trong phép phân tích tỉ số đồng vị 14N/15N sau đó, dung dịch mẫu cần được axit hóa với HCl ngay sau khi chuẩn độ.