Hình 1.9 mô tả cơ chế hoạt động của nguồn ESI. Dung môi chứa chất phân tích được phun vào một buồng phun tại áp suất khí quyển có sự hiện diện của trường tĩnh điện lớn và khí nóng làm khô. Trường tĩnh điện xảy ra giữa kim phun sương và ống mao quản (ống có điện thế cao). Để sử dụng chế độ dương hay âm,
ống mao quản sẽ được cài đặt ở thế dương hay âm. Sự phun xảy ra trực giao với
ống mao quản. Thiết kế này làm giảm ảnh hưởng nền từ các hạt sương, tăng độ
nhạy và giữống mao quản sạch hơn.
Ion hóa bằng phun điện tử (ESI) bao gồm bốn bước: sự hình thành của các ion, sự phun sương, loại dung môi, làm bay hơi ion. Các ion hình thành trong bộ
25
phân tích, dung môi, và dung dịch đệm là đúng thì các ion được tạo ra trong dung dịch trước khi được phun sương. Điều này dẫn đến nồng độ ion cao tăng độ nhạy cho chất phân tích. Tuy nhiên, với một số các hợp chất mà không ion hóa trong dung dịch vẫn có thể được áp dụng kỹ thuật này. Quá trình loại dung môi, phun sương, làm bay hơi ion tạo điện tích lớn trên bề mặt các hạt sương. Điều này có thể
gây ra sự ion hóa trong chất phân tích trên bề mặt của hạt sương. Chất phân tích
được phun ra ở dạng giọt sương, khí làm khô làm điện tích giọt sương nhỏ dần, lực coulomb lớn dần làm hạt sương vỡ ra thành những hạt nhỏ hơn, loại bỏ dung môi giải phóng ion chất phân tích.
Hình 1.9. Nguồn ion hóa ESI
Hình 1.10. Giải phóng ion khỏi dung dịch
Các ion hình thành được hút vào ống mao quản và đi vào bộ phận phân tích khối. Dung môi có ảnh hưởng lớn đến quá trình này. Dung môi sử dụng cần có nhiệt bay hơi thấp và sức căng bề mặt thấp, dung môi không làm trung hòa tính ion thông qua phản ứng pha khí như: chuyển proton hoặc ghép cặp ion. Để làm giảm sự tích tụ
26
thể sử dụng tốt cho cả các chất phân tích có khối lượng lớn như proteins, peptides… hoặc khối lượng phân tử nhỏ như thuốc, các chất ô nhiễm môi trường. Với các phân tử lớn thường sẽ có hơn một điện tích, nên dù bộ phận MS có thể phân tích trong vùng khối lượng 3000 m/z nhưng những phân tử có khối lượng lớn hơn và đa điện tích vẫn phân tích được. Ví dụ: 100,000 u / 10 z = 1,000 m/z. Đối với những phân tử lớn đa điện tích, thiết kế của máy cần có phần mềm Deconvolution & Bioanalysis hổ trợ tính toán chính xác khối lượng phân tử.
b. Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
APCI là quá trình ion hóa hóa học ở pha khí.
Hình 1.11. Nguồn ion hóa APCI
Hình 1.11 mô tả cơ chế hoạt động của nguồn ion hóa APCI. Dung môi chứa chất phân tích sau khi ra khỏi kim phun sương đến bộ phận gia nhiệt tạo thành hỗn hợp khí và hơi. Sau đó hỗn hợp đi qua vùng kim chích điện thế, tại đây hơi dung môi được ion hóa. Những hơi này ion hóa chất phân tích theo cơ chế ion hóa hóa học. Chất phân tích sau khi được ion hóa đi vào ống mao quản. Đối với kỹ thuật ion hóa này chất phân tích phải ở pha khí để sự ion hóa xảy ra. Để làm bay hơi dung môi và chất phân tích, nguồn ion hóa APCI phải hoạt động ở nhiệt độ 400-5000C. APCI áp dụng cho những chất phân tích có khoảng phân cực rộng. Chúng hiếm khi cho kết quảđa điện tích nên thường sử dụng cho các chất phân tích có khối lượng phân tử nhỏ hơn 1500 u. Bởi vì sự giới hạn về khối lượng phân tử và sử dụng nhiệt
27
hóa hơi cao nên APCI ít phù hợp hơn ESI trong việc phân tích các phân tử sinh học lớn, ít bền nhiệt.
c. Nguồn ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (APPI)
Với kỹ thuật này, dung môi chứa chất phân tích được kim phun sương phun ra ở dạng hạt sương mịn. Hạt sương được hóa hơi dần nhờ đi qua bộ phận gia nhiệt. Hỗn hợp khí/ hơi đi qua vùng chứa các tia photon của đèn Krypton để ion hóa chất phân tích (hình1.12). Sau đó, ion các chất phân tích được dẫn vào ống mao quản. APPI và APCI tương tự nhau, APPI sử dụng đèn thay cho kim chích điện để ion hóa các chất.
Hình 1.12. Nguồn ion hóa APPI
1.6.2.3. Bộ phận phân tích khối tứ cực và chếđộ quét:
Hình 1.13. Sơđồ cấu tạo của bộ tứ cực và sự di chuyển của ion trong tứ cực
Bộ tứ cực gồm 4 thanh kim loại hình trụ có kích thước như nhau và được đặt theo kiểu đối song từng đôi một, chịu tác dụng đồng thời của điện thế một chiều U
28
và điện thế xoay chiều cao tần V, từng cặp đối diện được nối vào cùng một cực của
điện thế. Các ion di chuyển bên trong tứ cực, những ion nào có quỹđạo bền với giá trị U và V áp vào thì sẽ đi đến được bộ dò ghi nhận tín hiệu, ngược lại những ion nào không có quỹ đạo bền sẽ bị va chạm với các cực và bị bơm chân không hút ra ngoài. Tứ cực Q1 có vai trò chọn lọc ion nhưng khi U = 0, chỉ còn điện thế xoay chiều cao tần V, tứ cực không còn đóng vai trò chọn lọc ion nữa. Tất cả các ion đều
đi qua tứ cực được, lúc bấy giờ tứ cực chỉđóng vai trò chuyển ion Q0.
Bộ phân tích khối tứ cực của thiết bị này có thể sử dụng ở hai chế độ quét Scan và SIM.
Hình 1.14. Bộ phân tích khối tứ cực hoạt động ở cả hai chếđộ Scan và Sim
Chếđộ Scan là chếđộ quét một vùng m/z ví dụ: m/z từ 200 đến 1000. Bộ tứ
cực lọc liên tiếp từng mảnh này đến mảnh khác với một thời gian quét cụ thể ( thời gian chính xác phụ thuộc vào vùng m/z cần quét và tốc độ quét). Phân tích bằng chế độ full scan có ích bởi vì nó cho biết những ion hiện diện trong nguồn ion hóa mà nằm trong vùng m/z đã chọn. Chế độ này thường dùng để xác định đặc tính mẫu, giải thích cấu trúc, độ không tinh khiết của chất phân tích. Nó đồng thời là điểm bắt
đầu cung cấp thông tin để sử dụng chếđộ Sim.
Chế độ quét Sim giúp tăng độ nhạy rất nhiều vì thời gian lấy tín hiệu cho từng ion nhiều hơn. Ở chế độ này, bộ tứ cực phân tích một vài giá trị m/z cụ thể. Thế RF/DC được cài đặt để lọc một mảnh tại một thời điểm nên nhạy hơn chế độ
29
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung:
Trong đề tài này, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng các chất màu gây ung thư bằng phương pháp HPLC-MS. Bao gồm các bước sau:
+ Tìm các thông số tối ưu của đầu dò MS để phân tích các chất màu nhuộm. + Tối ưu thành phần pha động trên HPLC để tách các chất màu.
+ Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu: theo tiêu chuẩn DIN 54231-2005 để được quy trình xử lý mẫu tối ưu.
+ Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng để đánh giá độ nhạy của quy trình phân tích đã được tối ưu.
+ Áp dụng quy trình này để khảo sát trên một số mẫu thật và tham gia vào chương trình đánh giá thành thạo của tổ chức IIS.
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ: 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC 1200 series Agilent quaternary pump) và bộ tiêm mẫu tựđộng.
- Đầu dò khối phổ (MSD 6120B Agilent với nguồn ion hóa API-ES). - Đầu dò diode array (Shimadzu).
- Cột Agilent ZORBAX Elipse C18, 4.6x 150 mm, kích thước hạt 5 µm. Cột bảo vệ
tương ứng.
- Lọ thủy tinh 20 ml có nắp cao su PTFE . - Micropipette 0.002- 5 mL
- Bể siêu âm (Ultrasonic bath – Elmasonic S100H ).
- Cân phân tích độ chính xác 0.01 g ( KERN 440-35A) và 0.1 mg (Shimadzu AX 200)
-Muỗng cân mẫu, muỗng cân chuẩn - Bộ lọc dung môi cho sắc ký lỏng - Lọ nhỏ 1.5 ml
30
- Màng lọc Nylon 0.22 µm.
2.2.2. Hóa chất, dung dịch:
- Chuẩn của các chất màu dạng rắn của hãng Dr.Ehrenstofer, Alrich-sigma và Fluka.
- Muối Amoniacetate (Merck, p.a).
- Dung môi: Acetonitril, Methanol (Merck loại dùng cho HPLC) - Dung môi: Iso propanol, Xylene, Formic acid (Merck, p.a). - Nước khử ion.
- Pha chuẩn hỗn hợp theo 2 nhóm như sau:
Bảng 2.1. Nồng độ gốc của các chuẩn hỗn hợp. Nhóm Số thứ tự Tên chất chuẩn Độ tinh khiết (%) Hãng m (g) (ppm) C
1 1 Direct Black 38 (DB38) 45.0 Sigma 0.0244 219.60
1 2 Direct Blue 6 (DB6) 92.0 Dr.Ehrenstofer 0.0111 204.24 1 3 Direct Brown 95 (DBr95) 100.0 Dr.Ehrenstofer 0.0109 218.00
1 4 Direct Red 28 (DR28) 91.0 Sigma 0.0106 192.92
1 5 Acid Red 26 (AV 26) 84.0 Fluka 0.0132 221.76
1 6 Acid Violet 49 (AV49) 96.0 Dr.Ehrenstofer 0.0108 207.36
1 7 Basic Red 9 (BR9) 80.0 Sigma 0.0118 188.80
1 8 Basic Violet 14 (BV14) 86.0 Sigma 0.0118 202.96
1 9 Basic Violet 1 (BV1) 80.0 Dr.Ehrenstofer 0.0127 203.20 1 10 Basic Violet 3 (BV3) 80.0 Dr.Ehrenstofer 0.0120 192.02
2 11 Disperse Blue 1 (DB1) 95.0 Fluka 0.0102 193.80
2 12 Disperse Orange 11 (DO11) 95.0 Sigma 0.0100 190.00 2 13 Disperse Yellow 3 (DY3) 30.0 Fluka 0.0305 183.00 2 14 Solvent Yellow 1 (SY1) 99.0 Dr.Ehrenstofer 0.0100 198.00 2 15 Solvent Yellow 2 (SY2) 99.5 Dr.Ehrenstofer 0.0104 206.96 2 16 Solvent Yellow 3 (SY3) 99.0 Dr.Ehrenstofer 0.0113 223.74
- Nhóm 1 (nhóm chất màu tan tốt trong nước) pha trong H2O:MeOH (80:20), thể
tích định mức 50 ml.
- Nhóm 2 (nhóm chất màu tan tốt trong dung môi hữu cơ) pha trong H2O:MeOH (20:80), thể tích định mức 50 ml. Pha riêng chuẩn BV3 định mức trong H2O:MeOH (20:80).
31
*() Ký hiệu viết tắt kế bên tên chất chuẩn là ký hiệu riêng dùng cho bài luận văn. - Pha chuẩn đơn: Các chất chuẩn màu DB38, DB6, DBr95, DR28, AR26, AV49, BR9, BV14, BV1, BV3 (nhóm 1) được pha riêng lẻ trong H2O:MeOH (80:20), thể tích định mức 2 0ml. Các chất chuẩn màu DB1, DO11, DY3 (nhóm 2) pha trong H2O:MeOH (20:80), định mức 20 ml. Các chất chuẩn màu SY1, SY2, SY3 (nhóm 2) pha trong H2O: MeOH (20:80), định mức 10 ml. Chúng tôi có được nồng độ như Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Nồng độ gốc của các chuẩn đơn
Số thứ tự Tên chất chuẩn m (g) Độ tinh khiết (%) Nồng độ C (ppm)
1 DB38 0.0102 45.0 229.50 2 DB 6 0.0112 92.0 515.20 3 DBr 95 0.0116 100.0 580.00 4 DR 28 0.0116 91.0 527.80 5 AR 26 0.0134 84.0 562.80 6 AV 49 0.0134 96.0 643.20 7 BR 9 0.0108 80.0 432.00 8 BV 14 0.0094 86.0 404.20 9 BV 1 0.0294 80.0 1176.00 10 BV 3 0.0280 80.0 1120.00 11 DB 1 0.0108 95.0 513.00 12 DO 11 0.0108 95.0 513.00 13 DY 3 0.0122 30.0 183.00 14 SY 1 0.0106 99.0 1049.40 15 SY 2 0.0106 99.5 1054.70 16 SY 3 0.0130 99.0 1287.00
32
2.3. Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ HPLC/MS
2.3.1. Kết quả khảo sát trên đầu dò MS 2.3.1.1. Tối ưu nguồn ion hóa
- Chúng tôi tiến hành điều chỉnh tự động và kiểm tra lại việc điều chỉnh trên chất chuẩn đi kèm với thiết bị ở cả hai chế độ dương và âm để đảm bảo máy ổn
định. Trong quá trình điều chỉnh, bộ phận MS sẽđược tối ưu về độ nhạy, độ phân giải và độ chính xác của các mảnh ion chuẩn.
Bảng 2.3. Các thông số trên đầu dò MS.
Tốc độ dòng khí làm khô: 10.0 L/p. Rough Vac : 0.03 psig. Áp suất chân không: 1.4*10-7 psig. Nhiệt độ khí làm khô: 3000C
Turbo1Pwr: 111.4 W. Thếống mao quản (dương): 3000V Nhiệt độ tứ cực: 1000C. Thếống mao quản (âm): -3000V Theo như đã biết ESI là nguồn ion hóa tốt cho chất phân tích là ion hoặc là chất phân cực đến hơi phân cực, APCI là nguồn ion hóa tốt cho chất có khối lượng phân tử nhỏ, độ phân cực vừa. Những chất màu đang nghiên cứu có một số có tính ion (chất màu trực tiếp: DB38, DB6, DBr95, DR28, chất màu acid: AR26, AV49, chất màu baz BV1, BV3, BR9, BV14) và một số chất có độ phân cực thấp như các chất màu phân tán: DY3, DO11, DB1, SY1, SY2, SY3 có thể sử dụng tốt nguồn ion hóa ESI.
- Dựa vào công thức cấu tạo, bản chất của các chất màu nhuộm và tài liệu tham khảo[12], [14], chúng tôi kết hợp sử dụng hai chếđộ dương và âm để có thể phân tích đồng thời các chất màu nhuộm.
- Các chất màu trực tiếp và acid, phần mang màu trong dung dịch tồn tại ở
dạng ion âm nên chúng tôi sử dụng chế độ âm. Các chất màu baz phần mang màu trong dung dịch ở dạng ion dương nên sử dụng chế độ dương. Các chất màu phân tán có khả năng nhận H+ nên cũng dùng ở chếđộ dương.
- Tiến hành tiêm từng chất chuẩn nồng độ 20 ppm theo chế độ Scan (xem phụ lục 1) ở cả 2 thế dương và âm từ 100-1000m/z. Có những chất thích hợp dùng chếđộ dương và những chất thích hợp dùng chếđộ âm (xem Bảng 2.4).
33
Chúng tôi thấy các ion dương cho độ nhạy tốt hơn rất nhiều so với các ion âm. Để tăng độ nhạy cho 16 chất màu chúng tôi sử dụng chế độ Sim trên những mảnh ion mẹđặc trưng có được từ chếđộ Scan.
Bảng 2.4. Mảnh ion mẹđặc trưng của các chất nhuộm
Các thuốc nhuộm Sim mảnh ion Các thuốc nhuộm Sim mảnh ion
DB 38 736.0 (M-2Na+H)- BV 1 358.0(M-Cl)+ DB 6 421.3 (M-4Na+2H)2- BV 3 372.0 (M-Cl)+ DBr 95 714.0 (M-2Na+H)- DB 1 269.0 (M+H)+ DR 28 651.0 (M-2Na+H)- DO 11 238.0 (M+H)+ AR 26 435.0 (M-2Na+H)- DY 3 270.0 (M+H)+ AV 49 710.1 (M-Na)- SY 1 198.0 (M+H)+ BR 9 288.0 (M-Cl)+ SY 2 226.0 (M+H)+ BV 14 302.0 (M-Cl)+ SY 3 226.0 (M+H)+
2.3.1.2. Khảo sát thế phân mảnh của các thuốc nhuộm: (xem phụ lục 2) - Theo nhưđã giới thiệu ở phần thiết bị, bộ phận MS ở đây có thểđiều chỉnh thêm thế phân mảnh. Thế này có tác dụng truyền ion vào bộ bát cực. Khi thế này càng lớn, các ion sẽ có động năng lớn va chạm với phân tử khí, các ion mảnh mẹ có thể sẽ phân mảnh thành ion con. Chúng tôi tiến hành xác định thế fragmentor của các chất cần phân tích nhằm mục đích lựa chọn thế tại đó chất phân tích vừa còn tồn tại ion mẹ, vừa có mảnh ion con để phục vụ cho mục đích định danh lại trong những trường hợp mẫu phức tạp như: chất trong mẫu có cùng mảnh ion và thời gian lưu trùng với chất cần phân tích. Để có thêm thông tin về mảnh ion con, chúng tôi tiến hành khảo sát phân mảnh ion con bằng cách sử dụng thế fragmentor ở 50V, 70V, 180V và 220V để xác định các ion con.
- Ở thế 50V không cho tín hiệu các chất.
- Ở thế 70V ta thấy cường độ ion mẹ là lớn nhất không thấy xuất hiện mảnh ion con.
34
- Bảng 2.5 dưới đây trình bày ion con xuất hiện ở thế khảo sát 180V và 220V.
Bảng 2.5. Các ion tương ứng với thế phân mảnh
Chất nhuộm Thế 180V DB38 736.2 (M-2Na+H)(100) - 722.0 (20) 141.1 (25) DB6 421.3 (M-4Na+2H)(100) 2- 248.9 (78) 185.0 (12) DBr95 715.1 (100) 481.1 (85) 272.0 (34) DR28 651.2 (M-2Na+H)(100) - 416.1 (30) 325.0 (M-2Na)(40) 2- AR26 449.0 (52) 435.0 (M-2Na+H) - (100) - AV49 710.3 (M-Na)(100) - 696.3 (710.3-CH3) (22) - BR 9 288.1 (M-Cl)(100) + - - BV14 316.1 (100) 302.1 (M-Cl)+ (80) 288.0 (21) BV1 358 (M-Cl)(100) + - - BV3 372 (M-Cl) + (100) - - DB1 269.1 (M+H)(100) + - - DO11 238 (M+H) + (100) - - DY3 270.1 (M+H)(25) + 108.1 (100) 150.0 (15) SY1 198.1 (M+H)(40) + 105.1 (C6H5N2) (100) - SY2 226.1 (M+H) + (100) 121.1 (M+H-CH3-C6H5N) (24) 105.1 (C6H5N2) (75) SY3 226.1 (M+H)(100) + 121.1 (M+H-CH3-C6H5N) (45) 106.1 (36)
35 Chất nhuộm Thế 220V DB38 736.0 (100) 722.0 (20) 632.0 (M-2Na+H- 105)- (15) DB6 420.9 (26) 248.9 (100) 185.0 (78) DBr95 714.9 (M-2Na+H)(100) + 480.9 (64) 287.1 (32) DR28 651.2 (M-2Na+H) - (100) - - AR26 435.0 (100) 449.1 (52) (14) 302 AV49 710.3 (M-Na)(100) - 696.3 (710.3-CH3) (22) 169.9 (12) BR 9 288.1 (M-Cl)+ (100) 195 (M-C6H6N) (24) - BV14 302.1 (80) (20) 288 195 (9) BV1 358.2 (M-Cl) + (100) - - BV3 372.2 (M-Cl)(100) + - - DB1 241.1 (25) 252.9 (40) (34) 107 DO11 223 (16) 195 (25) 167 (47) DY3 - 108.1 (100) 112.8 (36) SY1 - 152.1 (20) 105.1 (C(100) 6H5N2) SY2 133.1 (13) 120.1 (34) 105.1 (75) SY3 121.1 (30) 105.1 (74) 91.2 (60)
(): Số liệu trong ngoặc chỉ cường độ tương đối của các ion.
-Nhận xét-thảo luận:
Việc sử dụng chếđộ ion dương hay ion âm tùy vào công thức cấu tạo của các chất. Các chất màu trực tiếp và acid tồn tại trong dung dịch dạng phân ly thành ion âm mang màu và ion dương kim loại (cụ thể trong công thức các chất màu đang khảo
36
sát là ion Na+). Do đó các chất này sẽ dùng ở chếđộ âm. Những chất màu baz, phân