- Nhóm tác giả C. Wang đề cập đến cách xác định 16 chất màu gây ung thư
và gây dịứng theo phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò DAD. Cột sắc ký: C18 (250 mm*4.6 mm)
Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút. Pha động:
A: 15 mM citrate-20 mM tetrabutylammonium hydroxide, pH = 9 B: Tetrahydrofuran
C: Acetonitril
Theo chương trình gradient đã tối ưu, tác giả đã tách được hầu hết các chất màu. Tuy nhiên vẫn còn một số chất chưa tách tốt như: Disperse Orange 3 chập với Disperse Yellow 3, Disperse Blue 124 chập với Solvent Yellow 3, Solvent Yellow 2 chập với Disperse Orange 37. Vì các chất phân tích có nhóm màu nhuộm acid và
18
baz, sử dụng cột C18 nên tác giả dùng pha động là chất ghép cặp ion để các chất trao đổi ion lưu giữ tốt trên cột tại pH thích hợp. Với đầu dò DAD, sự ghép cặp này sẽảnh hưởng đến bước sóng. Tuy nhiên với đầu dò MS đặc biệt là MS một lần, việc sử dụng chất ghép cặp ion sẽ làm phổ đồ rất phức tạp, rất khó xác định mảnh ion
đặc trưng và vì ghép cặp ion làm giảm tính ion nên làm giảm độ nhạy ion chất phân tích. Đó có thể là lý do khi sử dụng đầu dò MS, tác giảđã không sử dụng pha động là chất ghép cặp ion nữa.
- Phương pháp xử lý mẫu: Mẫu được cắt nhỏ, cân 0.50 g chiết với 15 ml EtOH, siêu âm 15 phút, cô quay, hòa tan lại bằng 1 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0.2 µm rồi tiêm vào máy.
1.5.4. Phương pháp HPLC/MS/MS:
Một số bài báo gần đây, đề cập đến vấn đề cải thiện phương pháp kiểm tra các chất màu này bằng phương pháp HPLC/MS/MS. Một vài trong số các bài báo quan tâm đến việc xác định các chất màu thuộc nhóm màu phân tán gây dị ứng (allergenic dyes) và hai bài báo đề cập đến xác định 9 chất màu gây ung thư dựa trên qui trình xử lý mẫu theo tiêu chuẩn DIN 54321-2005. Tác giả C. Wang cùng với các cộng sựđã nghiên cứu phát triển phương pháp xác định một số chất nhuộm gây ung thư và gây dịứng bằng phương pháp LC/MS/MS.
Để khắc phục sự chập của các chất phân tích khi chạy ởđầu dò DAD, tác giả đã kết hợp với việc sử dụng đầu dò MS/MS[12].
- Cột sắc ký lỏng: C18 (150 mm*2.1 mm)
- Pha động: ACN:CH3COONH4 (5 mM, pH = 5) - Chương trình gradient:
- Tốc độ dòng: 0.3 ml/phút. - Giới hạn phát hiện: 10 mg/kg.
19
Bên cạnh đó, cùng với việc sử dụng phương pháp LC/MS. Tác giả Y.Fang tiến hành xác định 20 chất nhuộm màu phân tán bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò TOF.
- Cột pha tĩnh: Zorbax XDB-C8, 50 mm*2.1 mm*1.8 µm. - Nhiệt độ cột: 550C.
- Pha động: 5 mM CH3COONH4: ACN. Theo chương trình gradient. - Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút.
- Nguồn ion hóa: ESI dương.
- Tốc độ dòng khí làm khô: 10 l/phút. - Áp suất phun sương: 40 psig.
- Nhiệt độ khí làm khô: 3000C. - LOD: 0.1-1ng trên cột[15]
1.6. Khái quát về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ: 1.6.1. Khái quát về sắc ký lỏng hiệu năng cao[3]:
Hình 1.6. Sơđồ hoạt động của máy sắc ký lỏng.
- Nguyên lý của phương pháp: Dựa vào ái lực khác nhau giữa các chất cần phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng được tách ra nhờ thay đổi độ phân cực của dung môi pha động cùng với cột tách thích hợp. Việc định lượng được thực hiện bằng phương pháp ngoại chuẩn (so sánh giữa mẫu với chuẩn đã biết hàm lượng trong cùng điều kiện phân tích).
20
- Ưu điểm:
+ Có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau. Vì vậy tách được đồng phân và đồng đẳng của nhau.
+ Các đầu dò dùng trong HPLC có độ nhạy cao đặc biệt là đầu dò huỳnh quang và MS có thể phát hiện được hàm lượng vết (cỡ ppb).
+ Là phương pháp hữu hiệu trong việc định lượng các hợp chất hữu cơ có
nhiệt phân hủy thấp.
- Nhược điểm:
+ Thời gian làm sạch và ổn định cột sau các lần chạy lâu. + Thiết bịđắt tiền.
1.6.1.1. Bộ phận bơm trong HPLC:
Tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định ngay cả khi thành phần pha động thay đổi. Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ
dòng, độ nhớt pha động và kích thước pha tĩnh. Gồm hai chếđộ:
+ Chếđộđẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi. Nhược điểm: thời
gian phân tích dài, độ phân giải kém.
+ Chế độ gradient dòng: thành phần pha động thay đổi trong quá trình phân
tích. Ưu điểm: thời gian phân tích ngắn, độ phân giải tốt.
1.6.1.2. Pha động:
Dùng để chuyển chất cần phân tích từ loop tiêm đến đầu dò, có tương tác với chất cần phân tích, và đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất.
Pha động phải có độ tinh khiết cao, cần loại bỏ các khí hòa tan trong pha động
để tránh hiện tượng tạo bọt khí làm tốc độ dòng không ổn định ảnh hưởng đến thời gian lưu. Lưu lượng dòng phụ thuộc vào cột sắc ký sử dụng, được kiểm soát bởi bơm và thiết bịđo áp suất.
Pha động thường sử dụng cho sắc ký lỏng cột C18 ghép đầu dò khối phổ là ACN, MeOH, nước milipore, đệm amoni acetate, amoni format, acid formic, … thường ở nồng độ thấp để tránh ảnh hưởng đến đầu dò.
21
1.6.1.3. Bộ phận tiêm mẫu:
Bộ phận tiêm mẫu được sử dụng phổ biến nhất gồm một van sáu cổng trên có gắn một vòng chứa mẫu. Mẫu được tiêm vào loop bằng một kim tiêm.
Yêu cầu đối với bộ phận tiêm mẫu: thể tích cho vào phải rất đều, độ lặp lại cao.
1.6.1.4. Cột sắc ký:
Thường làm bằng thép không rỉ có đường kính cột: 2.1-7.6 mm, chiều dài cột: 1- 30 cm, đường kính hạt: 3-10 µm.
Yêu cầu đối với cột sắc ký: cột phải trơ có thành phẳng và chịu được áp suất cao.
Cột phân tích thường nối với một cột bảo vệ có thành phần chất nhồi trong cột tương tự cột phân tích để làm tăng tuổi thọ cột phân tích.
1.6.1.5. Đầu dò: là bộ phận phát hiện và ghi tín hiệu của chất cần phân tích khi chất đó ra khỏi cột. phân tích khi chất đó ra khỏi cột.
- Dựa vào tính chất của chất cần phân tích: + Hợp chất có màu: UV/VIS, mạng diode.
+ Hợp chất phát huỳnh quang: đầu dò huỳnh quang. + Hợp chất ion: đầu dò điện hóa.
+ Đầu dò MS: có tính phổ quát và chọn lọc.
1.6.2. Khái quát vềđầu dò khối phổ MS:
1.6.2.1. Nguyên tắc hoạt động của thiết bị MS Agilent 6100:
Đây là thiết bị phân tích dùng trong phần thực nghiệm. Ở đây, sự ion hoá của chất phân tích xảy ra tại áp suất khí quyển trong nguồn ion hóa. Sau khi ion được hình thành từ nguồn ion hóa ở áp suất khí quyển (760 torr). Ion được hướng vào vùng chân không sâu 10-6 torr, vào trong vùng tứ cực và được đầu dò ghi nhận tín hiệu.
22
Hình1.7. Cấu tạo nguồn MS của thiết bị MSD 6120B Agilent.
Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký lỏng, đi vào bộ phận ion hóa bằng kỹ thuật phun điện tử (ESI). Bộ phận này có nhiệm vụ tạo ra ion chất phân tích trong dung dịch trước khi chúng đi vào bộ phận lọc khối, phun sương, làm bay hơi dung môi và tạo ion trạng thái hơi. Chất phân tích được phun sương vào trong buồng ở áp suất khí quyển có sự hiện diện của lực trường tĩnh điện và gia nhiệt của khí làm khô. Lực trường tĩnh điện ở giữa bộ phun sương và ống mao quản (có điện thế cao). Sự
phun xảy ra thẳng góc với ống mao quản. Thiết kế này nhằm để giảm ảnh hưởng của nền, tăng độ nhạy và giữ cho ống mao quản sạch hơn vì hầu hết dung môi đều
được thổi ra ngoài, không vào trong ống mao quản. Chỉ ion, khí làm khô và một lượng rất nhỏ dung môi được chuyển vào ống mao quản. Bằng chế độ dò tự động của thiết bị, các yếu tố về thế ảnh hưởng đến đường đi của ion đều được chỉnh tự
động.
Vùng chân không đầu tiên là vùng chuyển và phân mảnh ion (Ion transport and fragmentation (first vacuum stage)): Các ion ra khỏi vùng áp suất khí quyển
được tích điện và đi vào ống mao quản được gia nhiệt. Skimmer có tác dụng hướng ion vào vùng chân không sâu. Những phân tử khí trơ nhẹ như N2 thường bị skimmer làm trệch hướng và bị bơm hút ra ngoài. Những ion đi qua skimmer sẽ vào vùng
23
chân không thứ hai. Kỹ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển là kỹ thuật ion hóa mềm. Những phân tử ion có thể hình thành như:
• Phân tử ion mẹ M+ hoặc M-
• Những phân tử bị proton hoá như: [M + H]+
• Những ion được cộng thêm phân tửđơn giản như: [M + Na]+ • Hoặc ion bị mất H2O như: [M + H - H2O]+
- Để có thêm thông tin cho việc định danh, xác định cấu trúc, chúng ta có thể phân mảnh ion chất phân tích trong vùng chân không đầu tiên bằng cách gia tăng thế để
chúng va đập với phân tử trung hòa. Dựa vào thế ở vùng này, ion mẹ di chuyển không thay đổi hoặc bị phân mảnh. Nếu thế áp vào thấp, các ion di chuyển không thay đổi. Mặc dù có sự va chạm với phân tử khí trong vùng này, nhưng năng lượng không đủ để phân mảnh. Nếu thế áp vào đủ lớn, các ion có năng lượng lớn sẽ va
đập với phân tử trung hòa cho ion con. Điều này sẽ cung cấp thêm thông tin cho việc định danh. Bộ hướng ion bát cực gồm những thanh kim loại song song có thế
RF để tập trung ion đi vào vùng tứ cực. Bộ phận tứ cực được áp thế RF và DC để
lọc khối lượng phân tử ion dựa vào tỉ lệ m/z.
Hình1.8. Bộ tứ cực phân tích khối.
1.6.2.2. Nguồn ion hóa:
Khi ghép bộ phận HPLC và MS với nhau, giữa chúng có những sự không tương thích cơ bản được liệt kê trong Bảng 1.3 bên dưới.
24
Bảng 1.3. So sánh sự không tương thích của bộ phận LC và MS
Máy HPLC hoạt động trong điều kiện: Máy khối phổ hoạt động trong điều kiện:
+ áp suất cao + chân không sâu
+ nhiệt độ tương đối thấp + nhiệt độ cao
+ các chất khảo sát ở thể lỏng + các chất khảo sát phải ở thể khí + vận tốc dòng chảy lớn (vài ml phút-1). + vận tốc dòng chảy nhỏ (vài µl phút-1). Do đó để ghép hai loại máy này lại với nhau cần có một giao diện. Có nhiều loại giao diện khác nhau dùng cho HPLC-MS như: chùm tia hạt (PB), bắn phá nhanh nguyên tử dòng liên tục (CF-FAB), tia điện (TSP), ion hóa bằng cách phun điện tử
(ESI), ion hóa hoá học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa quang ở áp suất khí quyển (APPI)…Tùy thuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính (phân cực hay không phân cực) của hợp chất phân tích mà ta sử dụng giao diện nào cho phù hợp. Thông dụng nhất là ba kĩ thuật giao diện tạo ion là ESI, APCI và APPI.
Thiết bị Agilent dòng 6100 tứ cực LC/MS hoạt động với nguồn ion hóa ở áp suất khí quyển gồm 3 loại ion hóa:
• ESI (ion hóa bằng cách phun điện tử)
• APCI (ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển)
• APPI (ion hóa quang học ở áp suất khí quyển)
a. Ion hóa bằng phun điện tử (ESI)
Hình 1.9 mô tả cơ chế hoạt động của nguồn ESI. Dung môi chứa chất phân tích được phun vào một buồng phun tại áp suất khí quyển có sự hiện diện của trường tĩnh điện lớn và khí nóng làm khô. Trường tĩnh điện xảy ra giữa kim phun sương và ống mao quản (ống có điện thế cao). Để sử dụng chế độ dương hay âm,
ống mao quản sẽ được cài đặt ở thế dương hay âm. Sự phun xảy ra trực giao với
ống mao quản. Thiết kế này làm giảm ảnh hưởng nền từ các hạt sương, tăng độ
nhạy và giữống mao quản sạch hơn.
Ion hóa bằng phun điện tử (ESI) bao gồm bốn bước: sự hình thành của các ion, sự phun sương, loại dung môi, làm bay hơi ion. Các ion hình thành trong bộ
25
phân tích, dung môi, và dung dịch đệm là đúng thì các ion được tạo ra trong dung dịch trước khi được phun sương. Điều này dẫn đến nồng độ ion cao tăng độ nhạy cho chất phân tích. Tuy nhiên, với một số các hợp chất mà không ion hóa trong dung dịch vẫn có thể được áp dụng kỹ thuật này. Quá trình loại dung môi, phun sương, làm bay hơi ion tạo điện tích lớn trên bề mặt các hạt sương. Điều này có thể
gây ra sự ion hóa trong chất phân tích trên bề mặt của hạt sương. Chất phân tích
được phun ra ở dạng giọt sương, khí làm khô làm điện tích giọt sương nhỏ dần, lực coulomb lớn dần làm hạt sương vỡ ra thành những hạt nhỏ hơn, loại bỏ dung môi giải phóng ion chất phân tích.
Hình 1.9. Nguồn ion hóa ESI
Hình 1.10. Giải phóng ion khỏi dung dịch
Các ion hình thành được hút vào ống mao quản và đi vào bộ phận phân tích khối. Dung môi có ảnh hưởng lớn đến quá trình này. Dung môi sử dụng cần có nhiệt bay hơi thấp và sức căng bề mặt thấp, dung môi không làm trung hòa tính ion thông qua phản ứng pha khí như: chuyển proton hoặc ghép cặp ion. Để làm giảm sự tích tụ
26
thể sử dụng tốt cho cả các chất phân tích có khối lượng lớn như proteins, peptides… hoặc khối lượng phân tử nhỏ như thuốc, các chất ô nhiễm môi trường. Với các phân tử lớn thường sẽ có hơn một điện tích, nên dù bộ phận MS có thể phân tích trong vùng khối lượng 3000 m/z nhưng những phân tử có khối lượng lớn hơn và đa điện tích vẫn phân tích được. Ví dụ: 100,000 u / 10 z = 1,000 m/z. Đối với những phân tử lớn đa điện tích, thiết kế của máy cần có phần mềm Deconvolution & Bioanalysis hổ trợ tính toán chính xác khối lượng phân tử.
b. Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
APCI là quá trình ion hóa hóa học ở pha khí.
Hình 1.11. Nguồn ion hóa APCI
Hình 1.11 mô tả cơ chế hoạt động của nguồn ion hóa APCI. Dung môi chứa chất phân tích sau khi ra khỏi kim phun sương đến bộ phận gia nhiệt tạo thành hỗn hợp khí và hơi. Sau đó hỗn hợp đi qua vùng kim chích điện thế, tại đây hơi dung môi được ion hóa. Những hơi này ion hóa chất phân tích theo cơ chế ion hóa hóa học. Chất phân tích sau khi được ion hóa đi vào ống mao quản. Đối với kỹ thuật ion hóa này chất phân tích phải ở pha khí để sự ion hóa xảy ra. Để làm bay hơi dung môi và chất phân tích, nguồn ion hóa APCI phải hoạt động ở nhiệt độ 400-5000C. APCI áp dụng cho những chất phân tích có khoảng phân cực rộng. Chúng hiếm khi cho kết quảđa điện tích nên thường sử dụng cho các chất phân tích có khối lượng phân tử nhỏ hơn 1500 u. Bởi vì sự giới hạn về khối lượng phân tử và sử dụng nhiệt
27
hóa hơi cao nên APCI ít phù hợp hơn ESI trong việc phân tích các phân tử sinh học lớn, ít bền nhiệt.
c. Nguồn ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (APPI)
Với kỹ thuật này, dung môi chứa chất phân tích được kim phun sương phun ra ở dạng hạt sương mịn. Hạt sương được hóa hơi dần nhờ đi qua bộ phận gia nhiệt. Hỗn hợp khí/ hơi đi qua vùng chứa các tia photon của đèn Krypton để ion hóa chất phân tích (hình1.12). Sau đó, ion các chất phân tích được dẫn vào ống mao quản. APPI và APCI tương tự nhau, APPI sử dụng đèn thay cho kim chích điện để ion hóa các chất.
Hình 1.12. Nguồn ion hóa APPI
1.6.2.3. Bộ phận phân tích khối tứ cực và chếđộ quét:
