Bộ phận tiêm mẫu được sử dụng phổ biến nhất gồm một van sáu cổng trên có gắn một vòng chứa mẫu. Mẫu được tiêm vào loop bằng một kim tiêm.
Yêu cầu đối với bộ phận tiêm mẫu: thể tích cho vào phải rất đều, độ lặp lại cao.
1.6.1.4. Cột sắc ký:
Thường làm bằng thép không rỉ có đường kính cột: 2.1-7.6 mm, chiều dài cột: 1- 30 cm, đường kính hạt: 3-10 µm.
Yêu cầu đối với cột sắc ký: cột phải trơ có thành phẳng và chịu được áp suất cao.
Cột phân tích thường nối với một cột bảo vệ có thành phần chất nhồi trong cột tương tự cột phân tích để làm tăng tuổi thọ cột phân tích.
1.6.1.5. Đầu dò: là bộ phận phát hiện và ghi tín hiệu của chất cần phân tích khi chất đó ra khỏi cột. phân tích khi chất đó ra khỏi cột.
- Dựa vào tính chất của chất cần phân tích: + Hợp chất có màu: UV/VIS, mạng diode.
+ Hợp chất phát huỳnh quang: đầu dò huỳnh quang. + Hợp chất ion: đầu dò điện hóa.
+ Đầu dò MS: có tính phổ quát và chọn lọc.
1.6.2. Khái quát vềđầu dò khối phổ MS:
1.6.2.1. Nguyên tắc hoạt động của thiết bị MS Agilent 6100:
Đây là thiết bị phân tích dùng trong phần thực nghiệm. Ở đây, sự ion hoá của chất phân tích xảy ra tại áp suất khí quyển trong nguồn ion hóa. Sau khi ion được hình thành từ nguồn ion hóa ở áp suất khí quyển (760 torr). Ion được hướng vào vùng chân không sâu 10-6 torr, vào trong vùng tứ cực và được đầu dò ghi nhận tín hiệu.
22
Hình1.7. Cấu tạo nguồn MS của thiết bị MSD 6120B Agilent.
Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký lỏng, đi vào bộ phận ion hóa bằng kỹ thuật phun điện tử (ESI). Bộ phận này có nhiệm vụ tạo ra ion chất phân tích trong dung dịch trước khi chúng đi vào bộ phận lọc khối, phun sương, làm bay hơi dung môi và tạo ion trạng thái hơi. Chất phân tích được phun sương vào trong buồng ở áp suất khí quyển có sự hiện diện của lực trường tĩnh điện và gia nhiệt của khí làm khô. Lực trường tĩnh điện ở giữa bộ phun sương và ống mao quản (có điện thế cao). Sự
phun xảy ra thẳng góc với ống mao quản. Thiết kế này nhằm để giảm ảnh hưởng của nền, tăng độ nhạy và giữ cho ống mao quản sạch hơn vì hầu hết dung môi đều
được thổi ra ngoài, không vào trong ống mao quản. Chỉ ion, khí làm khô và một lượng rất nhỏ dung môi được chuyển vào ống mao quản. Bằng chế độ dò tự động của thiết bị, các yếu tố về thế ảnh hưởng đến đường đi của ion đều được chỉnh tự
động.
Vùng chân không đầu tiên là vùng chuyển và phân mảnh ion (Ion transport and fragmentation (first vacuum stage)): Các ion ra khỏi vùng áp suất khí quyển
được tích điện và đi vào ống mao quản được gia nhiệt. Skimmer có tác dụng hướng ion vào vùng chân không sâu. Những phân tử khí trơ nhẹ như N2 thường bị skimmer làm trệch hướng và bị bơm hút ra ngoài. Những ion đi qua skimmer sẽ vào vùng
23
chân không thứ hai. Kỹ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển là kỹ thuật ion hóa mềm. Những phân tử ion có thể hình thành như:
• Phân tử ion mẹ M+ hoặc M-
• Những phân tử bị proton hoá như: [M + H]+
• Những ion được cộng thêm phân tửđơn giản như: [M + Na]+ • Hoặc ion bị mất H2O như: [M + H - H2O]+
- Để có thêm thông tin cho việc định danh, xác định cấu trúc, chúng ta có thể phân mảnh ion chất phân tích trong vùng chân không đầu tiên bằng cách gia tăng thế để
chúng va đập với phân tử trung hòa. Dựa vào thế ở vùng này, ion mẹ di chuyển không thay đổi hoặc bị phân mảnh. Nếu thế áp vào thấp, các ion di chuyển không thay đổi. Mặc dù có sự va chạm với phân tử khí trong vùng này, nhưng năng lượng không đủ để phân mảnh. Nếu thế áp vào đủ lớn, các ion có năng lượng lớn sẽ va
đập với phân tử trung hòa cho ion con. Điều này sẽ cung cấp thêm thông tin cho việc định danh. Bộ hướng ion bát cực gồm những thanh kim loại song song có thế
RF để tập trung ion đi vào vùng tứ cực. Bộ phận tứ cực được áp thế RF và DC để
lọc khối lượng phân tử ion dựa vào tỉ lệ m/z.
Hình1.8. Bộ tứ cực phân tích khối.
1.6.2.2. Nguồn ion hóa:
Khi ghép bộ phận HPLC và MS với nhau, giữa chúng có những sự không tương thích cơ bản được liệt kê trong Bảng 1.3 bên dưới.
24
Bảng 1.3. So sánh sự không tương thích của bộ phận LC và MS
Máy HPLC hoạt động trong điều kiện: Máy khối phổ hoạt động trong điều kiện:
+ áp suất cao + chân không sâu
+ nhiệt độ tương đối thấp + nhiệt độ cao
+ các chất khảo sát ở thể lỏng + các chất khảo sát phải ở thể khí + vận tốc dòng chảy lớn (vài ml phút-1). + vận tốc dòng chảy nhỏ (vài µl phút-1). Do đó để ghép hai loại máy này lại với nhau cần có một giao diện. Có nhiều loại giao diện khác nhau dùng cho HPLC-MS như: chùm tia hạt (PB), bắn phá nhanh nguyên tử dòng liên tục (CF-FAB), tia điện (TSP), ion hóa bằng cách phun điện tử
(ESI), ion hóa hoá học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa quang ở áp suất khí quyển (APPI)…Tùy thuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính (phân cực hay không phân cực) của hợp chất phân tích mà ta sử dụng giao diện nào cho phù hợp. Thông dụng nhất là ba kĩ thuật giao diện tạo ion là ESI, APCI và APPI.
Thiết bị Agilent dòng 6100 tứ cực LC/MS hoạt động với nguồn ion hóa ở áp suất khí quyển gồm 3 loại ion hóa:
• ESI (ion hóa bằng cách phun điện tử)
• APCI (ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển) • APPI (ion hóa quang học ở áp suất khí quyển)
a. Ion hóa bằng phun điện tử (ESI)
Hình 1.9 mô tả cơ chế hoạt động của nguồn ESI. Dung môi chứa chất phân tích được phun vào một buồng phun tại áp suất khí quyển có sự hiện diện của trường tĩnh điện lớn và khí nóng làm khô. Trường tĩnh điện xảy ra giữa kim phun sương và ống mao quản (ống có điện thế cao). Để sử dụng chế độ dương hay âm,
ống mao quản sẽ được cài đặt ở thế dương hay âm. Sự phun xảy ra trực giao với
ống mao quản. Thiết kế này làm giảm ảnh hưởng nền từ các hạt sương, tăng độ
nhạy và giữống mao quản sạch hơn.
Ion hóa bằng phun điện tử (ESI) bao gồm bốn bước: sự hình thành của các ion, sự phun sương, loại dung môi, làm bay hơi ion. Các ion hình thành trong bộ
25
phân tích, dung môi, và dung dịch đệm là đúng thì các ion được tạo ra trong dung dịch trước khi được phun sương. Điều này dẫn đến nồng độ ion cao tăng độ nhạy cho chất phân tích. Tuy nhiên, với một số các hợp chất mà không ion hóa trong dung dịch vẫn có thể được áp dụng kỹ thuật này. Quá trình loại dung môi, phun sương, làm bay hơi ion tạo điện tích lớn trên bề mặt các hạt sương. Điều này có thể
gây ra sự ion hóa trong chất phân tích trên bề mặt của hạt sương. Chất phân tích
được phun ra ở dạng giọt sương, khí làm khô làm điện tích giọt sương nhỏ dần, lực coulomb lớn dần làm hạt sương vỡ ra thành những hạt nhỏ hơn, loại bỏ dung môi giải phóng ion chất phân tích.
Hình 1.9. Nguồn ion hóa ESI
Hình 1.10. Giải phóng ion khỏi dung dịch
Các ion hình thành được hút vào ống mao quản và đi vào bộ phận phân tích khối. Dung môi có ảnh hưởng lớn đến quá trình này. Dung môi sử dụng cần có nhiệt bay hơi thấp và sức căng bề mặt thấp, dung môi không làm trung hòa tính ion thông qua phản ứng pha khí như: chuyển proton hoặc ghép cặp ion. Để làm giảm sự tích tụ
26
thể sử dụng tốt cho cả các chất phân tích có khối lượng lớn như proteins, peptides… hoặc khối lượng phân tử nhỏ như thuốc, các chất ô nhiễm môi trường. Với các phân tử lớn thường sẽ có hơn một điện tích, nên dù bộ phận MS có thể phân tích trong vùng khối lượng 3000 m/z nhưng những phân tử có khối lượng lớn hơn và đa điện tích vẫn phân tích được. Ví dụ: 100,000 u / 10 z = 1,000 m/z. Đối với những phân tử lớn đa điện tích, thiết kế của máy cần có phần mềm Deconvolution & Bioanalysis hổ trợ tính toán chính xác khối lượng phân tử.
b. Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
APCI là quá trình ion hóa hóa học ở pha khí.
Hình 1.11. Nguồn ion hóa APCI
Hình 1.11 mô tả cơ chế hoạt động của nguồn ion hóa APCI. Dung môi chứa chất phân tích sau khi ra khỏi kim phun sương đến bộ phận gia nhiệt tạo thành hỗn hợp khí và hơi. Sau đó hỗn hợp đi qua vùng kim chích điện thế, tại đây hơi dung môi được ion hóa. Những hơi này ion hóa chất phân tích theo cơ chế ion hóa hóa học. Chất phân tích sau khi được ion hóa đi vào ống mao quản. Đối với kỹ thuật ion hóa này chất phân tích phải ở pha khí để sự ion hóa xảy ra. Để làm bay hơi dung môi và chất phân tích, nguồn ion hóa APCI phải hoạt động ở nhiệt độ 400-5000C. APCI áp dụng cho những chất phân tích có khoảng phân cực rộng. Chúng hiếm khi cho kết quảđa điện tích nên thường sử dụng cho các chất phân tích có khối lượng phân tử nhỏ hơn 1500 u. Bởi vì sự giới hạn về khối lượng phân tử và sử dụng nhiệt
27
hóa hơi cao nên APCI ít phù hợp hơn ESI trong việc phân tích các phân tử sinh học lớn, ít bền nhiệt.
c. Nguồn ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (APPI)
Với kỹ thuật này, dung môi chứa chất phân tích được kim phun sương phun ra ở dạng hạt sương mịn. Hạt sương được hóa hơi dần nhờ đi qua bộ phận gia nhiệt. Hỗn hợp khí/ hơi đi qua vùng chứa các tia photon của đèn Krypton để ion hóa chất phân tích (hình1.12). Sau đó, ion các chất phân tích được dẫn vào ống mao quản. APPI và APCI tương tự nhau, APPI sử dụng đèn thay cho kim chích điện để ion hóa các chất.
Hình 1.12. Nguồn ion hóa APPI
1.6.2.3. Bộ phận phân tích khối tứ cực và chếđộ quét:
Hình 1.13. Sơđồ cấu tạo của bộ tứ cực và sự di chuyển của ion trong tứ cực
Bộ tứ cực gồm 4 thanh kim loại hình trụ có kích thước như nhau và được đặt theo kiểu đối song từng đôi một, chịu tác dụng đồng thời của điện thế một chiều U
28
và điện thế xoay chiều cao tần V, từng cặp đối diện được nối vào cùng một cực của
điện thế. Các ion di chuyển bên trong tứ cực, những ion nào có quỹđạo bền với giá trị U và V áp vào thì sẽ đi đến được bộ dò ghi nhận tín hiệu, ngược lại những ion nào không có quỹ đạo bền sẽ bị va chạm với các cực và bị bơm chân không hút ra ngoài. Tứ cực Q1 có vai trò chọn lọc ion nhưng khi U = 0, chỉ còn điện thế xoay chiều cao tần V, tứ cực không còn đóng vai trò chọn lọc ion nữa. Tất cả các ion đều
đi qua tứ cực được, lúc bấy giờ tứ cực chỉđóng vai trò chuyển ion Q0.
Bộ phân tích khối tứ cực của thiết bị này có thể sử dụng ở hai chế độ quét Scan và SIM.
Hình 1.14. Bộ phân tích khối tứ cực hoạt động ở cả hai chếđộ Scan và Sim
Chếđộ Scan là chếđộ quét một vùng m/z ví dụ: m/z từ 200 đến 1000. Bộ tứ
cực lọc liên tiếp từng mảnh này đến mảnh khác với một thời gian quét cụ thể ( thời gian chính xác phụ thuộc vào vùng m/z cần quét và tốc độ quét). Phân tích bằng chế độ full scan có ích bởi vì nó cho biết những ion hiện diện trong nguồn ion hóa mà nằm trong vùng m/z đã chọn. Chế độ này thường dùng để xác định đặc tính mẫu, giải thích cấu trúc, độ không tinh khiết của chất phân tích. Nó đồng thời là điểm bắt
đầu cung cấp thông tin để sử dụng chếđộ Sim.
Chế độ quét Sim giúp tăng độ nhạy rất nhiều vì thời gian lấy tín hiệu cho từng ion nhiều hơn. Ở chế độ này, bộ tứ cực phân tích một vài giá trị m/z cụ thể. Thế RF/DC được cài đặt để lọc một mảnh tại một thời điểm nên nhạy hơn chế độ
29
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung:
Trong đề tài này, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng các chất màu gây ung thư bằng phương pháp HPLC-MS. Bao gồm các bước sau:
+ Tìm các thông số tối ưu của đầu dò MS để phân tích các chất màu nhuộm. + Tối ưu thành phần pha động trên HPLC để tách các chất màu.
+ Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu: theo tiêu chuẩn DIN 54231-2005 để được quy trình xử lý mẫu tối ưu.
+ Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng để đánh giá độ nhạy của quy trình phân tích đã được tối ưu.
+ Áp dụng quy trình này để khảo sát trên một số mẫu thật và tham gia vào chương trình đánh giá thành thạo của tổ chức IIS.
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ: 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC 1200 series Agilent quaternary pump) và bộ tiêm mẫu tựđộng.
- Đầu dò khối phổ (MSD 6120B Agilent với nguồn ion hóa API-ES). - Đầu dò diode array (Shimadzu).
- Cột Agilent ZORBAX Elipse C18, 4.6x 150 mm, kích thước hạt 5 µm. Cột bảo vệ
tương ứng.
- Lọ thủy tinh 20 ml có nắp cao su PTFE . - Micropipette 0.002- 5 mL
- Bể siêu âm (Ultrasonic bath – Elmasonic S100H ).
- Cân phân tích độ chính xác 0.01 g ( KERN 440-35A) và 0.1 mg (Shimadzu AX 200)
-Muỗng cân mẫu, muỗng cân chuẩn - Bộ lọc dung môi cho sắc ký lỏng - Lọ nhỏ 1.5 ml
30
- Màng lọc Nylon 0.22 µm.
2.2.2. Hóa chất, dung dịch:
- Chuẩn của các chất màu dạng rắn của hãng Dr.Ehrenstofer, Alrich-sigma và Fluka.
- Muối Amoniacetate (Merck, p.a).
- Dung môi: Acetonitril, Methanol (Merck loại dùng cho HPLC) - Dung môi: Iso propanol, Xylene, Formic acid (Merck, p.a). - Nước khử ion.
- Pha chuẩn hỗn hợp theo 2 nhóm như sau:
Bảng 2.1. Nồng độ gốc của các chuẩn hỗn hợp. Nhóm Số thứ tự Tên chất chuẩn Độ tinh khiết (%) Hãng m (g) (ppm) C
1 1 Direct Black 38 (DB38) 45.0 Sigma 0.0244 219.60
1 2 Direct Blue 6 (DB6) 92.0 Dr.Ehrenstofer 0.0111 204.24 1 3 Direct Brown 95 (DBr95) 100.0 Dr.Ehrenstofer 0.0109 218.00
1 4 Direct Red 28 (DR28) 91.0 Sigma 0.0106 192.92
1 5 Acid Red 26 (AV 26) 84.0 Fluka 0.0132 221.76
1 6 Acid Violet 49 (AV49) 96.0 Dr.Ehrenstofer 0.0108 207.36
1 7 Basic Red 9 (BR9) 80.0 Sigma 0.0118 188.80
1 8 Basic Violet 14 (BV14) 86.0 Sigma 0.0118 202.96
1 9 Basic Violet 1 (BV1) 80.0 Dr.Ehrenstofer 0.0127 203.20 1 10 Basic Violet 3 (BV3) 80.0 Dr.Ehrenstofer 0.0120 192.02
2 11 Disperse Blue 1 (DB1) 95.0 Fluka 0.0102 193.80
2 12 Disperse Orange 11 (DO11) 95.0 Sigma 0.0100 190.00 2 13 Disperse Yellow 3 (DY3) 30.0 Fluka 0.0305 183.00 2 14 Solvent Yellow 1 (SY1) 99.0 Dr.Ehrenstofer 0.0100 198.00 2 15 Solvent Yellow 2 (SY2) 99.5 Dr.Ehrenstofer 0.0104 206.96 2 16 Solvent Yellow 3 (SY3) 99.0 Dr.Ehrenstofer 0.0113 223.74
- Nhóm 1 (nhóm chất màu tan tốt trong nước) pha trong H2O:MeOH (80:20), thể
tích định mức 50 ml.
- Nhóm 2 (nhóm chất màu tan tốt trong dung môi hữu cơ) pha trong H2O:MeOH (20:80), thể tích định mức 50 ml. Pha riêng chuẩn BV3 định mức trong H2O:MeOH (20:80).
31
*() Ký hiệu viết tắt kế bên tên chất chuẩn là ký hiệu riêng dùng cho bài luận văn. - Pha chuẩn đơn: Các chất chuẩn màu DB38, DB6, DBr95, DR28, AR26, AV49, BR9, BV14, BV1, BV3 (nhóm 1) được pha riêng lẻ trong H2O:MeOH (80:20), thể tích định mức 2 0ml. Các chất chuẩn màu DB1, DO11, DY3 (nhóm 2) pha trong H2O:MeOH (20:80), định mức 20 ml. Các chất chuẩn màu SY1, SY2, SY3 (nhóm 2) pha trong H2O: MeOH (20:80), định mức 10 ml. Chúng tôi có được nồng độ như Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Nồng độ gốc của các chuẩn đơn
Số thứ tự Tên chất chuẩn m (g) Độ tinh khiết (%) Nồng độ C (ppm)