PHẦN 2 : LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.3. Sơ lược về vi khuẩn cố định đạm và cơ chế cố định đạm sinh học
2.3.1. Sơ lược về vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas
- Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực, có khả năng di chuyển tốt trong nước, không tạo bào tử. Chúng sống tự do, hiện diện khắp nơi trong đất, nước, thực vật, động vật (Chan, 1994). Chúng có khả
năng hơ hấp hiếu khí hay kị khí trong mơi trường khơng có oxy. Nhiệt độ thích hợp cho Pseudomonas phát triển là 30–37oC, một số lồi có thể sống ở 40o
C.
Pseudomonas có thể được ni trong môi trường đơn giản và ở pH trung tính.
Một vài chủng có thể tạo huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng
254nm. (http//www.texbookofbacteriology.net/Pseudomonas.ect.html)
- Giống (chi) vi khuẩn Pseudomonas có hơn 140 lồi, hầu hết thuộc nhóm hoại sinh (Iglewski và Woods, 1983). Vi khuẩn Pseudomonas spp. Phân bố rộng rãi và đa dạng nhiều chủng loài (Rangarajan et al., 2001; 2002). Loài Pseudomonas
stuzeri được xác định khả năng cố định đạm từ lâu (Krotzsky và Werner, 1987)
và loài vi khuẩn Alcagenes faecalis A15 là một loài vi khuẩn cố định đạm cho
cây lúa cao sản đã được nhân dân Trung Quốc sử dụng (Yiu et al, 1983) nhưng sau đó nó được các nhà khoa học Bỉ phân loại chính xác dựa trên bộ gen của nó
là Pseudomonas stuzeri (Vermeiren et al, 1999), thế nhưng các lồi thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm được xác định từ những năm 1994 (Chan
et al., 1994) và một số nghiên cứu đã chứng minh những loài thuộc giống vi
khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta,
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas paucimibilis, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas putida, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas stuzeri và Pseudomonas vesicularis. (Chan et al., 1994)
- Mật số vi khuẩn Psedomonas vùng rễ bị ảnh hưởng bởi nồng độ muối trong đất, nồng độ muối cao sẽ làm giảm mật số vi khuẩn. Một số dịng có khả năng chịu
được nồng độ muối cao như Pseudomonas alcaligenes và Pseudomonas
pseudoalcaligenes. (Rangarajen et al., 2002)
- Một số chủng Pseudomonas có vai trị quan trong trong sự sinh trưởng và phát triển của thực vật như:
+ Tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật: auxin, cytokinin kích thích sự phát triển của bộ rễ làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất như loài Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
syringae. (Suzuki, 2003)
+ Hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thu
như: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlororaphis. (Cattenlla et al., 1999)
+ Một số chủng có khả năng cố định đạm từ nguồn nitơ khơng khí như:
Pseudomonas stuzeri (Krotzsky et al., 1987). Pseudomonas diminuta, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas sacharophila, Pseudomonas stuzeri, Pseudomonas vesicularis (Chan et al., 1994).
+ Một số chủng có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây hại cho cây trồng như: Pseudomonas fluorescens HP72 chống nấm Rhizoctionia solani. (Suzuki, 2003)
+ Một số dịng Pseudomonas có khả năng khử đạm như: Pseudomonas
aeruginosa, lồi này có khả năng tăng trưởng được trên mơi trường nghèo dinh
dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn cacbon thích hợp như acetate, pyruvat, succinat, glucose… Theo Curtis và Ingraham (1983) trong những điều kiện nhất
định, loài này khử nitơ tạo sản phẩm NO2 nhiều hơn N2. Ngồi ra, Pseudomonas stuzeri cũng có khả năng khử nitrat thành nitơ phân tử, có thể tăng trưởng trong
maltose và tinh bộ.t (Bennasar et al., 1998b; Sikorski et al., 1999)
2.3.2. Cơ chế cố định đạm sinh học
- Vi khuẩn Pseudomonas spp. là một trong những dòng vi khuẩn sống trong đất vùng rễ cây, chúng có khả năng cố định đạm cung cấp cho cây lúa và kích thích
sự phát triển của cây lúa tương tự như vi khuẩn nội sinh (Cao Ngọc Điệp, 2005).
Dòng Pseudomonas stuzeri A15 đã được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở Trung
Quốc và đã dự kiến đưa vào sản xuất phân bón sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp. (http//www.agr.kleuven.ac.be/dtp/cmpg.htm)
- Cố định đạm là quá trình khử N2 thành NH3 dưới sự xúc tác của hệ enzyme nitrogenase. Sau đó, NH3 có thể kết hợp với các acid hữu cơ để tạo thành protein. Trong khơng khí, N2 ở dạng rất bền, chiếm 78.16% theo thể tích và 75.5% theo khối lượng. Cây trồng cũng như các lồi động vật và người khơng có khả năng
đồng hóa trực tiếp nguồn N2 dồi dào này. (Nester et al., 2004)
- Quá trình cố định đạm xảy ra trong tế bào vi khuẩn nhờ chúng có hệ thống gen
nif điều khiển quá trình tổng hợp ezyme nitrogenase. Enzyme nitrogenase xúc tác
cho phản ứng khử N2 thành NH3. Hệ thống gen nif được xem là hệ thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm sinh học. (Heldt, 1999)
- N2 tự do ở trạng thái rất bền nhờ liên kết ba (N = N) của nó tương ứng với năng lượng tự do là 942kJ/mol. Trong điều kiện tự nhiên, những liên kết ba này chỉ có thể bị bẻ gãy nhờ nguồn năng lượng nhiệt rất cao, có thể đến 4000oC nhờ những tia lửa điện khi có sấm sét. Trong công nghiệp sản xuất phân đạm, NH4+ được tạo từ khí N2 trong phản ứng Harber xảy ra ở 400-500oC với áp suất vài trăm atm (atmostphere). Trong quá trình cố định đạm sinh học, sự khử N2 lại xảy ra trong
điều kiện sinh lý bình thường nhờ năng lượng ATP và sự xúc tác của emzyme
* Cấu tạo emzyme nitrogenase:
Hình 2.2. Cấu tạo enzyme nitrogenase
- Nitrogenase là một phức hệ enzyme, được cấu tạo bởi 2 protein. Cả 2 protein đều là phân tử nhỏ và có hoạt tính xúc tác.
+ 1 protein sắt (protein Fe – dinitrogenase reductase) là protein nhỏ hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 6000 Da, gồm 2 tiểu đơn vị giống nhau, chứa tâm oxy hóa-khử Fe4-S4, có 2 vị trí gắn ATP.
+ 1 protein sắt – molibden (protein Mo-Fe – dinitrogenase): là protein lớn hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 240.000 Da, có cấu tạo từ 2 tiểu đơn vị khác nhau chứa nhân Fe, Mo và tâm oxy hóa – khử.
- Tổng cộng, nitrogenase chứa 2 nguyên tử Mo, 32 nguyên tử Fe và 30 nguyên tử S. Nguyên tố Mo là nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố S rất linh động.
- Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:
N2 + 6H+ + 6e- Nitrogenase 2NH3
NH3 sẽ kết hợp acid hữu cơ thành protein:
NH3 + Acid hữu cơ Amino acid Protein
- Cơ chế cố định đạm sinh học có thể trình bày theo phương trình sau đây, trong
đó 2 phân tử ammonium được sản xuất từ 1 phân tử N2 cùng với 16 ATP, 8 điện tử và 8 ion H+
N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP 2NH3 + H2+16ATP + 16Pi
- Số nguyên tử Fe và nguyên tử S có thể khơng ổn định với acid. Phân tử protein nhỏ hơn có chức năng vận chuyển e-, trong đó e- của ferredoxin hoặc flavodoxin vận chuyển lên phức hệ Mo-Fe.
- Nitrogenase có cấu trúc FeMo-co có khối giữa là Fe7S8 kết hợp với một phân tử homocitrat với phần đuôi là Mo. Cả hai phân tử FeMo-co hiện diện trong một
enzyme nitrogenase. Sự cố định nitơ hình thành khi các chất cho điện tử
flavodoxin chuyển điện tử đến dinitrogenase reductase và chuyển tiếp đến
ditrogenase, cung cấp các điện tử dưới dạng H2 đến các N2 tạo thành NH3. Sau
đó, NH3 kết hợp với các acid hữu cơ tạo ra các acid amin hữu dụng cho cây trồng. (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009).
- Emzyme nitrogenase có cấu tạo bởi 2 protein: 1 protein Fe và 1 Protein Mo-Fe. Phản ứng cố định đạm xảy ra theo trình tự protein Fe sẽ khử và cung cấp điện tử trước để cung cấp điện tử trong ferredoxin. Kế đến, protein Mo-Fe khử và cung cấp điện tử đến N2 để tạo thành NH=NH. Trong 2 chu kỳ tiếp theo cũng đòi hỏi cung cấp điện tử để tạo ra H2N=NH2 từ NH=NH, và cuối cùng tạo NH3 từ H2N=NH2. (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009).
- Ngồi ra, trong q trình vận chuyển e- cần năng lượng do ATP cung cấp. ATP kết hợp với protein chứa Fe qua một cầu Mg và sau đó được thủy phân thành
ADP và Pi. Sự thủy phân đã làm thay đổi hình dạng của protein enzyme, e- được vận chuyển lên phức hệ Fe-Mo. Để vận chuyển 1e- cần 2ATP. Phức hệ Fe-Mo thực chất là 1 N2-reductase. Phức hệ nhỏ hơn là 1protein chứa Fe, phức hệ lớn hơn là protein chứa Fe/Mo, phức lớn này thực chất là dinitrogenase-reductase.
- Để vận chuyển e- từ phức Fe/Mo đến N2 thì sự thay đổi hóa trị Mo có một vai trị quan trọng.
1. 2e- và 2H+ được kết hợp với nguyên tử Mo
2. Nguyên tử H2 đang gắn với enzyme bị đẩy ra bởi N2
3. N2 được khử thành –N=N do tiếp nhận H+ + e- 4. –N=N được khử thành =N-NH do tiếp nhận H+ + e-
5. =N-NH2 được khử thành NH3 do tiếp nhận H+ + e-, NH3 được tách ra khỏi
phức hệ enzyme
6. Nguyên tử N đang gắn với enzyme được khử thành NH3 do tiếp nhận 3e-
và 3H+ và sau đó NH3 được tách ra khỏi phức hệ.
- Sự gắn N2 với phức hệ Fe-Mo cần một liên kết trước đó của phức hệ này với H2. Vì vậy, kết quả là bên cạnh tạo ra NH3 còn xuất hiện H2, phân tử này có thể
được tách ra thành H+ và e- và e- này được đưa trở lại hệ thống.