3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu thí nghiệm
- Giống lúa: OM4218
Đặc tính sinh trưởng của giống lúa OM4218:
+ Thời gian sinh trưởng: 90-95 ngày.
+ Chiều cao cây: 96-104cm, có khả năng chịu phèn nhẹ, chống chịu vàng lùn-lùn xoắn lá tốt, ít đỗ ngã.
+ Trọng lượng 1000 hạt: 26,1-28gam
+ Năng suất bình qn 6-8 tấn/ha, thích nghi cả 3 vụ trong năm. Hạt gạo dài, trong, vỏ trấu mỏng, mềm cơm.
(http://www.giongnongnghiep.com/giong-lua/giong-lua-trien-vong/123-ging-lua- om-4218.html)
- Phân bón: Super lân Long Thành, urea, kali dạng KCl
- Đất: Lấy từ tỉnh Hậu Giang
- Vi khuẩn: Tuyển chọn 3 dịng vi khuẩn có khả năng cố định đạm đã được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ lúa ở Cần Thơ. Dựa trên kết quả đo NH4+ bằng phương pháp phenol nitroprusside trong đề tài nghiên cứu khoa học đang thực
hiện và kết quả 10 dịng vi khuẩn trồng lúa thí nghiệm trong chậu đất của Lê Thị Tám.
Bảng 3.1. Nguồn gốc 3 dịng vi khuẩn chọn thí nghiệm
STT Vi khuẩn Kết quả đo NH4+ Nguồn gốc
1 vk1 = PĐ3 24,3 mg/l Phân lập từ mẫu đất thu ở huyện Phong Điền-CT
2 vk2 = NK3 5,9 mg/l Phân lập từ mẫu đất thu ở quận Ninh Kiều-CT
3 vk3 = CĐ4 5,7 mg/l Phân lập từ mẫu đất thu ở huyện Cờ Đỏ-CT
Bảng 3.2. Trọng lượng khô cây lúa trồng trong chậu đất với 10 dòng vi khuẩn
STT Vi khuẩn Trọng lượng khô (g) STT Vi khuẩn Trọng lượng khô (g) 1 CR4 1,5725 7 CĐ3 1,5384 2 PĐ3 2,0336 8 CĐ1 1,6718 3 NK3 2,0656 9 CR3 1,5630 4 CĐ4 1,8821 10 BT2 0,7145 5 TN2 0,7673 11 0vk+0N 1,4440 6 NK2 1,8516 12 0vk+100%N 2,2433
Dựa vào kết quả bảng 3.2 chọn ra 3 dòng vòng vi khuẩn ở 3 nghiệm thức có
trọng lượng khơ cây lúa cao hơn các nghiệm thức cịn lại để tiến hành trồng thí nghiệm trong chậu có kết hợp các mức độ đạm khác nhau (0%N, 25%N, 50%N, 75%N), chậu trồng lúa được đặt trong nhà lưới.
3.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng thiết bị và dụng cụ của phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học – Khoa Khoa Học Tự Nhiên.
- Đĩa petri, kim cấy, đèn cồn, ống đong, micropipette, đầu cone
- Tủ sấy Memmert (Đức)
- Tủ lạnh trữ mẫu Sanyo (Nhật Bản)
- Tủ ủ vi sinh vật Memmert (Đức)
- Máy lắc mẫu Heidolph MR 3001 (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt HVE-50 (Nhật Bản)
- Máy chụp hình
- Cân điện tử Mettler Toler (Switzerland)
- pH kế Thermo election corporation (Mỹ)
- Máy trộn mẫu Vortex
- Máy ly tâm MIKRO 12-24 (Trung Quốc)
- Ống nhựa 50ml, chậu trồng lúa (thể tích 5 lít, cao 17cm, đường kính mặt
20cm), bảng so màu lá lúa
- Nhà lưới
Hình 3.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm
Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Tủ ủ
3.1.3. Hóa chất
3.1.3.1. Ni cấy và trữ vi khuẩn
Môi trường Pseudomonas isolation Agar 46,1g/l (Difco) bao gồm: - Pepton 29g/l - Magnesieum chloride 1,4g/l - Potassium sulfate 10g/l - Irgasan TM 25mg/l - Agar 13,6g/l - Glycerol pH=7
3.1.3.2. Nuôi sinh khối vi khuẩn
Môi trường Minimal bao gồm:
- Sodium succinat 8,1g/l - NaNO3 11g/l - NH4Cl 0.54g/l - K2HPO4 4,35mg/l - KH2PO4 3.3mg/l - Môi trường SW: + NaHCO3 0.11g/l + MgSO4.7H2O 10.5g/l + NaCl 24g/l pH=6,8 (Sikorsky et al, 2002)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian: từ tháng 3-5/2011
Địa điểm: Phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học và nhà lưới vườn sinh vật khoa
Khoa học tự nhiên.
3.2.2. Thí nghiệm trồng lúa trong chậu
Thời gian thực hiện thí nghiệm trồng lúa trong chậu là 36 ngày. Thí nghiệm gồm 26 nghiệm thức với 3 lần lặp lại trên 72 chậu.
Bảng 3.3. Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm
STT Nghiệm thức Ký hiệu
nghiệm thức
1 Không chủng vi khuẩn cố định đạm + bón 100% đạm
(đối chứng dương) NT1
2 Không chủng vi khuẩn cố định đạm + khơng bón đạm
(đối chứng âm) NT2 3 Chủng vi khuẩn 1 + khơng bón N NT3 4 Chủng vi khuẩn 1 + bón 25%N NT4 5 Chủng vi khuẩn 1 + bón 50%N NT5 6 Chủng vi khuẩn 1 + bón 75%N NT6 7 Chủng vi khuẩn 2 + khơng bón N NT7 8 Chủng vi khuẩn 2 + bón 25%N NT8 9 Chủng vi khuẩn 2 + bón 50%N NT9 10 Chủng vi khuẩn 2 + bón 75%N NT10 11 Chủng vi khuẩn 3+ khơng bón N NT11 12 Chủng vi khuẩn 3 + bón 25%N NT12 13 Chủng vi khuẩn 3 + bón 50%N NT13 14 Chủng vi khuẩn 3 + bón 75%N NT14 15 Chủng vi khuẩn 1+2 + bón 25%N NT15 16 Chủng vi khuẩn 1+2 + bón 50%N NT16 17 Chủng vi khuẩn 1+2 + bón 75%N NT17 18 Chủng vi khuẩn 1+3 + bón 25%N NT18 19 Chủng vi khuẩn 1+3 + bón 50%N NT19 20 Chủng vi khuẩn 1+3 + bón 75%N NT20 21 Chủng vi khuẩn 2+3 + bón 25%N NT21 22 Chủng vi khuẩn 2+3 + bón 50%N NT22 23 Chủng vi khuẩn 2+3 + bón 75%N NT23 24 Chủng vi khuẩn 1+2+3 + bón 25%N NT24 25 Chủng vi khuẩn 1+2+3 + bón 50%N NT25 26 Chủng vi khuẩn 1+2+3 + bón 75%N NT26
Quy trình trồng lúa thí nghiệm trong chậu
- Chuẩn bị đất: Đất thí nghiệm được lấy từ ruộng lúa ở Hậu Giang. Đất lấy về
phơi. Lượng đất cho vào mỗi chậu 3,5kg (cách miệng chậu khoảng 5cm). Cho
nước vào ngập ngâm 48 giờ. Ngâm xả phèn, mỗi ngày xả thay nước. Bón lót vơi, lân 1 ngày trước khi gieo.
Hình 3.3. Chuẩn bị đất trồng lúa
- Chuẩn bị hạt giống: Hạt giống được xử lý với HNO3 1o/oo trong 24 giờ để phá miên trạng hạt và loại bỏ một số vi sinh vật gây hại. Tiếp tục ngâm oxy già trong 3 phút, ngâm cồn 70o trong 3 phút, rửa lại với nước cất 5-6 lần. Ủ giống trong đĩa petri có sẵn mơi trường agar 0,8% đã được khử trùng để nguội, ủ 2-3 ngày hạt lúa vừa nảy mầm khoảng 3-5mm. Chủng vi khuẩn vào hạt giống 3 giờ trước khi gieo
Ngâm HNO3 24 giờ Ngâm oxy già 3 phút Ngâm cồn 3 phút
Rửa với nước cất 5-6 lần
Hạt nảy mầm Ủ 2-3 ngày
- Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường Minimal đặt trên máy lắc lắc liên tục trong 3 ngày. Ngày thứ 3 kiểm tra mật số vi khuẩn bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu. Nếu số tế bào vi khuẩn đạt thì tiến hành chủng vào hạt giống đã nảy mầm.
* Kiểm tra mật số vi khuẩn trước khi chủng vào hạt giống: Kiểm tra bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu
- Buồng đếm hồng cầu:
Buồng đếm hồng cầu là một lam kính dày (kích thước 7cmx3cmx0,5cm, trên mặt
ở chính giữa có 3 rãnh sâu tạo thành hình chữ H. Buồng đếm nằm ở phần trên và
dưới rãnh ngang. Mỗi buồng được chia làm nhiều ô, tổng số 225 ô. Các ô này
được gọi là các ô lớn, mỗi ô lớn lại được chia làm 4 theo chiều dọc hoặc ngang
và một số ơ được chia làm 16 ơ vng nhỏ có kích thước mỗi cạnh bằng 1/20mm và sâu 1/10mm. Thể tích 1 ơ nhỏ là: 1/20x1/20x1/20=1/4000mm3 (Trịnh Hữu Hằng, 2001).
- Cách đếm vi khuẩn trên buồng đếm hồng cầu:
Đếm số tế bào vi khuẩn trong 5 ô lớn hay 80 ô nhỏ (4 ô ở 4 gốc và 1 ô ở giữa).
Vi khuẩn được nuôi bằng môi trường minimal trong 3 ngày. Môi trường chứa vi khuẩn được pha loãng ra 100 lần trước khi đếm mật số. Gọi tổng số tế bào vi khuẩn đếm được trong 80 ơ nhỏ là A, thể tích 1 ơ nhỏ là 1/4000mm3
Số tế bào vi khuẩn trong 1mm3
= (A x 4000 x 100)/80 - Kết quả kiểm tra mật số vi khuẩn:
+ Số tế bào vk1/mm3 = (278 x 4000 x 100)/80 = 1,39.106 = 1,39.109tb/ml + Số tế bào vk2/mm3
= (305 x 4000 x 100)/80 = 1,53.106 = 1,53.109tb/ml + Số tế bào vk3/mm3
= (297 x 4000 x 100)/80 = 1,49.106 = 1,49.109tb/ml Theo TCVN 6169 (1996), mật số để đạt chủng vào hạt giống là 106-109tb/ml. Vậy mật số của 3 dòng vi khuẩn trên đã đủ để chủng vào hạt giống.
- Cách gieo hạt: Dùng kẹp gắp gieo vào mỗi chậu 10 hạt lúa đã nảy mầm.
Các nghiệm thức được đặt vào nhà lưới ở vườn sinh vật. Thường xuyên theo dõi lượng nước trong các chậu, không để lúa bị khô nước. Khi lúa được 10 ngày
- Bón phân: Các thời điểm bón phân và lượng phân bón được trình bày ở bảng
sau
Diện tích đất trong mỗi chậu: 3,14 x 92
= 254,3cm2 = 0,02543m2
Cơng thức bón phân: 90N – 80P – 50K cho 1ha (10000m2) cho toàn vụ lúa Bảng 3.4. Các thời kỳ bón và lượng phân bón cho lúa
Các thời kỳ bón N P K
Bón lót - 50% -
Thúc lần 1 (7-10 ngày sau khi gieo) 30% - 30% Thúc lần 2 (18-20 ngày sau khi gieo) 40% 50% 35% Thúc lần 3 (40-45 ngày sau khi gieo) 30% - 35%
Bón lót: 0N + 50%P + 0K
Phân P: 50% x 80 = 40kg/ha
Lượng P bón cho 1 chậu: (40x0,02543)/10000 = 0,0001017kg = 0,1017g Phân super lân 12,5%P > lượng super lân cần bón cho 1 chậu:
(0,1017x100)/12,5 = 0,8136g
Bón thúc lần 1: 30%N + 0P + 30%K
+ Phân N: 30% x 90 = 27kg/ha
Lượng N bón cho 1 chậu: (27x0,02543)/10000 = 0,0000687kg = 0,0687g Phân ure 46%N > lượng ure cần bón cho 1 chậu: (0,0687x100)/46 = 0,15g Nghiệm thức 25%N bón: 0,0375g/chậu
Nghiệm thức 50%N bón: 0,075g/chậu Nghiệm thức 75%N bón: 0,1125g/chậu
Nghiệm thức 100%N (đối chứng +) bón: 0,15g/chậu + Phân K: 30% x 50 = 15kg/ha
Lượng K bón cho 1 chậu: (15x0,02543)/10000 = 0,0000381kg = 0,0381g Phân kali 60%K > lượng kali cần bón cho 1 chậu: (0,0381x100)/60 = 0,0635g
Bón thúc lần 2: 40%N + 50P + 35%K
+ Phân N: 40% x 90 = 36kg/ha
Phân ure 46%N > lượng ure cần bón cho 1 chậu: (0,0915x100)/46 = 0,1989g Nghiệm thức 25%N bón: 0,0497g/chậu
Nghiệm thức 50%N bón: 00,0995g/chậu Nghiệm thức 75%N bón: 0,1492g/chậu
Nghiệm thức 100%N (đối chứng +) bón: 0,1989g/chậu + Phân P: 50% x 80 = 40kg/ha
Lượng P bón cho 1 chậu: (40x0,02543)/10000 = 0,0001017kg = 0,1017g Phân super lân 12,5%P > lượng super lân cần bón cho 1 chậu:
(0,1017x100)/12,5 = 0,8136g + Phân K: 35% x 50 = 17,5kg/ha
Lượng K bón cho 1 chậu: (17,5x0,02543)/10000 = 0,0000445kg = 0,0445g Phân kali 60%K > lượng kali cần bón cho 1 chậu: (0,0445x100)/60 = 0,0742g
Bón thúc lần 3: 30%N + 0P + 35%K
+ Phân N: 30% x 90 = 27kg/ha
Lượng N bón cho 1 chậu: (27x0,02543)/10000 = 0,0000687kg = 0,0687g Phân ure 46%N > lượng ure cần bón cho 1 chậu: (0,0687x100)/46 = 0,15g Nghiệm thức 25%N bón: 0,0375g/chậu
Nghiệm thức 50%N bón: 0,075g/chậu Nghiệm thức 75%N bón: 0,1125g/chậu
Nghiệm thức 100%N (đối chứng +) bón: 0,15g/chậu + Phân K: 35% x 50 = 17,5kg/ha
Lượng K bón cho 1 chậu: (17,5x0,02543)/10000 = 0,0000445kg = 0,0445g Phân kali 60%K > lượng kali cần bón cho 1 chậu: (0,0445x100)/60 = 0,0742g
Bảng 3.5. Lượng phân bón cụ thể cho từng lần bón
Các đợt bón Urê Super lân Kali
Bón lót - 0,8136g/chậu - Thúc lần 1 NT 25%N: 0,0375g/chậu NT 50%N: 0,075g/chậu NT 75%N: 0,01125g/chậu NT 100%N: 0,15g/chậu - 0,0635g/chậu Thúc lần 2 NT 25%N: 0,0497g/chậu NT 50%N: 0,0995g/chậu NT 75%N: 0,1492g/chậu NT 100%N: 0,1989g/chậu 0,8136g/chậu 0,0742g/chậu Thúc lần 3 NT 25%N: 0,0375g/chậu NT 50%N: 0,075g/chậu NT 75%N: 0,01125g/chậu NT 100%N: 0,15g/chậu - 0,0742g/chậu * Ghi chú: (-) khơng bón
Thường xuyên theo dõi thí nghiệm để ghi nhận các chỉ tiêu và phát hiện kịp thời các sâu bệnh. Khi lúa được 10 ngày sau khi gieo, nhổ bỏ bớt cịn lại 3 cây/chậu, tiến hành bón thúc lần 1. Khi lúa được 36 ngày sau khi gieo, nhổ 1 cây/chậu (mỗi nghiệm thức nhổ 3 cây) đem sấy 48 giờ, cân trọng lượng khô.
* Các chỉ tiêu cần ghi nhận ở các nghiệm thức
Các chỉ tiêu được ghi nhận 4 lần ở các ngày: 15, 22, 29, 36 ngày. - Lần 1:
15 ngày sau khi gieo đo chiều cao cây từ gốc đến chóp lá cao nhất, đếm số
chồi/bụi, số lá/bụi (đếm tất cả số chồi và số lá/bụi).
So màu lá lúa, mỗi cây chọn 1 lá ở vị trí thứ 3 từ ngọn trở xuống, dùng phần giữa của phiến lá được chọn và so dọc lên bảng so màu lá lúa để xem màu lá trùng vào ô số nào của bảng so màu và ghi nhận lại (Phạm Chí Nguyên, 2006).
Tương ứng 22, 29 ngày sau khi gieo đo chiều cao cây, đếm số chồi/bụi, số lá/bụi (đếm tất cả số chồi và số lá/bụi), so màu lá.
- Lần 4:
36 ngày sau khi gieo đo chiều cao cây, đếm số chồi/bụi, số lá/bụi (đếm tất cả số chồi và số lá/bụi), so màu lá.
Thu hoạch 1 bụi lúa/chậu rửa sạch bộ rễ, đo chiều cao cây, đếm số chồi/bụi, số
lá/bụi, đo chiều dài rễ (từ gốc đến chóp rễ dài nhất). Mỗi nghiệm thức thu được 3 bụi đem sấy 48 giờ sau đó cân trọng lượng khơ lấy trọng lượng trung bình.
3.3. Xử lý kết quả
Các số liệu ghi nhận từ kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel và Minitab.
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn cố định đạm lên sự tăng trưởng về chiều cao của cây lúa cao của cây lúa
Dựa vào bảng 4.1 ta thấy chiều cao trung bình cây lúa tăng dần ở các thời điểm lấy chỉ tiêu 15 ngày, 22 ngày, 29 ngày và 36 ngày sau khi gieo (SKG).
- Thời điểm 15 ngày SKG: Chiều cao cây giữa các nghiệm thức chưa thể hiện rõ sự khác biệt. Chiều cao cây dao động trong khoảng từ 27,3cm đến 29,7cm, giữa các nghiệm thức khác biệt khơng có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
- Thời điểm 22 ngày SKG: Chiều cao cây bắt đầu có sự khác biệt. Chiều cao cây
ở các nghiệm thức 75%N+vk1, 50%N+vk2, 75%N+vk2, 75%N+vk1+vk2+vk3
tương đương với đối chứng dương, cao hơn đối chứng âm từ 6,50% đến 7,78%
và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (độ tin cậy 95%) so với đối chứng âm.
- Thời điểm 29 ngày SKG: Chiều cao cây ở nghiệm thức 50%N+vk1+vk2 và hầu hết các nghiệm thức 0N+vk, 25%N+vk có chiều cao cây thấp hơn đối chứng
dương và không khác biệt với đối chứng âm. Nghiệm thức 25%N+vk2,
25%N+vk3 và các nghiệm thức cịn lại có chiều cao cây cao tương đương và
khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng dương với độ tin cậy 95%, chiều cao cây cao hơn đối chứng âm từ 11,63% đến 22,18%. Trong đó, nghiệm
thức 75%N+vk3 và 50%N+vk2+vk3 có chiều cao cây trội hơn so với các nghiệm thức khác, tăng 21,77% và 22,18% so với đối chứng âm và cao hơn đối chứng
dương 1,29% và 1,64%.
- Thời điểm 36 ngày SKG: Hầu hết các nghiệm thức 0N+vk, 25%N+vk có chiều cao thấp hơn đối chứng dương và khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm. Nghiệm thức chủng vk3 kết hợp với 25%N và các nghiệm thức cịn lại có chiều cao cây cao tương đương và khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng dương với độ tin cậy 95%, chiều cao cây tăng từ 12,59% đến
21,51% so với đối chứng âm. Trong đó, nghiệm thức 75%N+vk3 có chiều cao
Nhìn chung, kết quả thống kê cho thấy vi khuẩn cố định đạm có tác động lên sự tăng trưởng chiều cao của cây lúa trồng trong chậu. Tuy nhiên, thời điểm 15 ngày SKG chưa thấy được sự tác động của vi khuẩn cố định đạm. Thời điểm 22 ngày, chiều cao cây giữa các nghiệm thức bắt đầu thể hiện sự khác biệt. Thời điểm 29 ngày và 36 ngày SKG, lúa này cây lúa đang trong giai đoạn nảy chồi mạnh nên nhu cầu N cũng tăng cao vì thế sự khác biệt về chiều cao cây trong giai đoạn này thể hiện rõ. Hầu hết các nghiệm thức có chủng vi khuẩn cố định đạm nhưng