4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.4 Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2 bằng
PCR (Polymerase Chain Reaction).
Sau khi đo nồng độ ADN khuôn, tính và tạo các nồng độ ADN của các mẫu nhƣ nhau để khi đƣa vào mỗi ống phản ứng thể tích ADN khuôn giống nhau và đạt khoảng 50mg trong tổng thể tích là 25 µl/1 phản ứng.
Gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi F1.2 và R1.2 có trình tự nhƣ sau:
Mồi xuôi F1.2: 5’-GCGGGGTGTTTAAACGAATA-3’ Mồi ngƣợc R1.2: 3’-ATTAGTGCTGCGTGTGTGTTCG-5’ Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (µl) dNTPs 5 mM Buffer 10X F1.2 0,6 mM R1.2 0,6 mM 1,0 2,5 0,3 0,3
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
ADN temperlate RNase- free water Taq 5,0 15,6 0,3 Tổng 25 Chu trình phản ứng: - 95ºC/ 5phút - 95ºC/ 30 giây - 60ºC/30 giây 30 Cycles - 72ºC/ 30 giây - 72º C/ 5phút
Kết quả PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,5%.
2.4.5 Phương pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Trong điện trƣờng đều thì các phân tử axit nucleic tích điện
âm sẽ di chuyển về phía cực dƣơng. Tốc độ chuyển động của chúng trong điện trƣờng có hiệu điện thế không đổi phụ thuộc hai yếu tố: dạng tồn tại và kích thƣớc của axit nucleic. Các axit nucleic có kích thƣớc càng lớn thì chuyển động càng chậm, các axit nucleic dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn dạng thẳng. Sau một khoảng thời gian dịch chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân tử có kích thƣớc (trọng lƣợng) khác nhau sẽ tách xa vị trí ban đầu di chuyển những khoảng khác nhau. Do đó chúng đƣợc tách. Ta có thể phát hiện đƣợc chúng nhờ các kỹ thuật nhuộm khác nhau nhƣ kỹ thuật nhuộm Ethidium Bromide (EtBr), kỹ thuật nhuộm bạc…
Cách tiến hành:
+ Cân 0,2 gam agarose cho vào 20 ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi dung
dị ến khi agarose tan hế - ). Sau đó để nguội
khoả 1 ổ vào khuôn gel đã lắp sẵn lƣợc để tạo các
giếng nhỏ, khoảng 20 - 30 phút sau khi gel đã nguội hoàn toàn thì rút lƣợc và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.
+ Tra mẫu: lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1 - 2 μg ADN), trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát và giúp cho các phân tử ADN lắng xuống trong quá trình điện di) sau đó tra vào các giếng của gel.
+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 110 V, thời gian 20 - 30 phút.
+ Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nƣớc rồi quan sát và chụp ảnh dƣới ánh sáng tia tử ngoại có bƣớc sóng λ = 260 nm.
2.4.6 Tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2
2.4.6.1. Phản ứng cắt đầu bằng sản phẩm PCR
Trƣớc khi tiến hành tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2 chúng tôi tiến hành phản ứng Klenow cắt đầu bằng sản phẩm PCR.
Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Sản phẩm PCR Buffer dNTPs 5 mM Enzyem Klenow RNase- free water
30,0 4,0 0,4 1,0 5,0 Tổng 40 Chu trình nhiệt: 37ºC/15 phút 75ºC/10 phút
2.4.6.2. Tạo vector tái tổ hợp:
Sau khi cắt đầu bằng sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành phản ứng lai tạo vector tái tổ hợp. Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Buffer 2X Sản phẩm cắt Klewnov Vector pJET1.2/blunt RNase- free water Enzyme T4 ligase 10,0 2,0 1,0 6,0 1,0 Tổng 20 Ủ 22ºC trong 10 phút
2.4.6.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10b:
* Chuẩn bị tế bào khả biến
1. Cấy chu n các tế bào E. coli DH10b từ ống nghiệm giữ giống vào
ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng LB. Nuôi cấy lắc qua đêm ở 37°C.
2. Cấy 500 µl dịch nuôi cấy trên vào 50 ml môi trƣờng LB, nuôi cấy lắc ở
37°C trong 2 giờ đến khi đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,3 - 0,6.
3. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C, loại dịch thu sinh khối tế bào.
4. Hòa sinh khối trong 25 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trên nƣớc
đá 30 phút.
5. Ly tâm thu sinh khối tế bào với vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C.
6. Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 1 ml dung dịch CaCl2
100 mM.
*Biến nạp vào tế bào E. coli DH10b
1. Cho toàn bộ phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp. Ủ trên nƣớc đá 30 phút.
2. Gây sốc nhiệt ở 42°C - 90 giây. Chuyển vào khay đá, ủ trong 2 phút. 3. Bổ sung 500 µl môi trƣờng LB và nuôi ủ hoạt hóa trong 1 giờ.
4. Trải 100 µl dịch trên đĩa LB đặc + Ampicilin (100 µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.
2.4.6.4. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E. coli
Nguyên tắc : Vi khuẩn đƣợc nuôi và nhân lên đến cuối giai đoạn log. Tế bào
đƣợc phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh, plasmid đƣợc thu lại bằng cách tủa với ethanol.
Quy trình :
1. Chọn các khuẩn lạc mọc trên đĩa LB + Ampicilin 100 µg/ml nuôi trong
2ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicilin với nồng độ 100 µg/ml,
nuôi lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút.
2. Hút 1 ml dịch nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 1,5 ml.
4. Bổ sung 150 µl Sol I (Glucoza 50 mM; Tris-HCl 50 mM, pH = 8,0; EDTA 10 mM, pH = 8,0 ), trộn đều bằng máy vortex.
5. Bổ sung 150 µl Sol II (NaOH 200 mM; SDS 1% ), đảo nhẹ bằng tay.
6. Bổ sung 150 µl Sol III (Potasium acetat 3 M, pH = 5,5), đảo nhẹ bằng tay.
7. Bổ sung 450 µl Chloroform : Isoamyalcohol (24 : 1), đảo nhẹ.
8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút .
9. Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới .
10. Bổ sung 1/10 lần thể tích NaOH 3 M và 2,5 lần etanol 100%.
11. Tủa ADN plasmid bằng cách ủ ở - 200C trong 2 giờ hoặc - 850C trong
30 phút.
12. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút, thu tủa .
13. Bổ sung 500 µl etanol 70% để rửa cặn ADN.
14. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.
15. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa và làm khô trong box.
16. Hòa tủa trong 40 µl TE-RNAse (100 μg/ml).
17. Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1 – 2 giờ để loại ARN.
18. Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.4.6.5. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR
Phản ứng PCR đƣ ợc thực hi ện với 2 cặp mồi F1.2, R1.2 và c ặp mồi của vector pJET1.2/blunt (F -pJET1.2 và R -pJET1.2).
Thành phần phản ứng với cặp mồi F1.2 và R1.2: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) dNTPs 5 mM Buffer 10X F1.2 0,6 mM R1.2 0,6 mM DNA temperlate RNase- free water Taq 1,0 2,5 0,3 0,3 1,0 19,6 0,3 Tổng 25
Thành phần phản ứng với cặp mồi F-pJET1.2 và R-pJET1.2: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) dNTPs 5 mM Buffer 10X F-pJET1.2 0,6 mM R-pJET1.2 0,6 mM DNA temperlate RNase- free water Taq 1,5 1,5 0,5 0,5 1,0 18,7 0,3 Tổng 25 Chu trình phản ứng: - 95ºC/ 5phút - 95ºC/ 30 giây - 60ºC/30giây 30 Cycles - 72ºC/ 30 giây - 72º C/ 5phút
2.4.5.6. Tinh sạch vector tái tổ hợp
Để tinh sạch vector tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, chúng tôi
sử dụng bộ kit PurelinkTMPCR purification kit củ
:
1. Bổ sung 200 µl binding buffer vào 50 µl plasmid. Mix đều.
2. Chuyển toàn bộ mẫu sang cột tách. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút
ở nhiệt độ phòng.
3. Loại bỏ dịch, giữ lại cột.
4. Bổ sung 650 µl wash buffer vào cột, ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút
ở nhiệt độ phòng.
5. Loại bỏ dịch, thu cột.
6. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại hết dịch.
8. Bổ sung 50 µl RNase- free water vào giữa cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
9. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút. Thu dịch có chứa plasmid sạch,
bỏ cột.
10. Điện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch trên gel Agarose 0,8%.
2.4.6.7. Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100
Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp Sanger
(phƣơng pháp dideoxy) có sử dụng các dideoxynucleotit: Dựa trên nguyên tắc hoạt động của enzym ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN. Enzym ADN polymerase xúc tác gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp ở vị trí 3’-OH.
Đặc trƣng của phƣơng pháp dideoxy là ngoài bốn loại nucleotit thông thƣờng còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotit (ddNTP) là những deoxynucleotit trong đó nhóm H thay thế cho nhóm 3’-OH. Do ddNTP bị mất 2 nhóm OH (ở cacbon số 2 và số 3), nên quá trình tổng hợp mạch ADN, gặp ngẫu nhiên một dideoxynucleotit sẽ làm cho phản ứng tổng hợp ADN ngừng lại. Trong kỹ thuật xác định trình tự bằng máy tự động, mỗi loại dideoxynucleotit đƣợc đánh dấu bằng một hóa chất huỳnh quang có màu khác nhau. Nhƣ vậy, tất cả các oligonucleotit cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotit sẽ cùng một màu.
Máy tổng hợp các mạch đơn ADN mới trên cả hai mạch khuôn ADN, đồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính để xử lý kết quả giúp kiểm soát đƣợc các sai sót, đảm bảo độ chính xác.
Kết quả đƣợc xử lý trên phần mềm PC/Gene và đƣợc so sánh với trình tự đã đƣợc công bố trong ngân gen quốc tế bằng chƣơng trình BLAST (Basis Local Aligment Search Tool) qua dữ liệu của DDGJ EMBL để tìm xem mức độ tƣơng đồng của chủng nghiên cứu với loài nào là lớn nhất.
2.4.6.8. Tạo dòng chủng biểu hiện gene mã hóa RoTAT 1.2
Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) bằng phƣơng pháp SDS-kiềm
Cấy chuyền các tế bào E.coli 5α có mang plasmid pET-32a(+) từ ống nghiệm giữ
30µg/ml. Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 37°C. Ly tâm thu sinh khối (13000 vòng/phút, 5 phút). Bổ sung 100 µl dung dịch I vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn, vortex thật kỹ. Bổ sung 200 µl dung dịch II, đảo nhanh eppendorf thật nhẹ nhàng. Ủ trên nƣớc đá 5 phút. Thêm 150 µl dung dịch III, đảo eppendorf thật kỹ cho đến khi thấy tủa trắng xuất hiện. Ủ 5 phút trong đá. Ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút - 10 phút ở 4°C. Thu dịch nổi từ eppendorf trên vào một eppendorf khác. Thu nhận ADN plasmid bằng phƣơng pháp tủa với ethanol tuyệt đối lạnh. Hòa tủa trong 20 µl TE 1X + 2 µl RNase 10 mg/ml, bảo quản ở -20°C.
Tạo vector tái tổ hợp
Thiết lập phản ứng cắt plasmid pET-32a (+) và sản phẩm PCR trong thể tích 20 µl: pET-32a (+) /sản phẩm PCR 10 µl, buffer 10X 2 µl, BSA 10X 2 µl, Bam HI (10 unit/ul 0,5 µl, Xho I ( 10 unit/ul) 0,5 µl. Phản ứng đƣợc thực hiện ở 37°C trong 4 giờ, sau đó đƣợc ủ ở 65°C trong 10 phút. Kết quả của phản ứng cắt đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1,5%.
Thiết lập phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp: buffer T4 ADN ligase 10X 1 µl, sản phẩm cắt pET-32a (+) 2 µl, sản phẩm cắt gene R o T A T 1 . 2 6 µl, T4 ADN ligase (1 unit/µl) 1 µl. Phản ứng nối đƣợc thực hiện ở 4°C qua đêm.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21
Cấy chuyền các tế bào E. coli BL21 từ ống nghiệm giữ giống vào ống
nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng LB. Nuôi cấy lắc qua đêm ở 37°C. Cấy 500 µl dịch nuôi cấy trên vào 50 ml môi trƣờng LB, nuôi cấy lắc ở 37°C trong 2 giờ đến khi đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,3 - 0,6. Ly tâm thu sinh khối tế bào (5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C). Hòa sinh khối trong 25 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trên nƣớc đá 30 phút. Ly tâm thu sinh khối tế bào với vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C. Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM. Cho toàn bộ phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp. Ủ trên nƣớc đá 30 phút. Gây sốc nhiệt ở 42°C trong 90 giây. Chuyển vào khay đá, ủ trong 2 phút. Bổ sung 900 µl môi trƣờng LB và nuôi ủ hoạt hóa trong 1 giờ. Ly tâm thu sinh khối (10000 vòng/phút trong 1 phút). Cô đặc và trải dịch huyền phù vi khuẩn trên đĩa LB đặc + kanamycin (30 µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.
Chọn lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp pET32a/RoTAT 1.2 bằng PCR trên khuẩn lạc Khuẩn lạc từ môi trƣờng LB rắn + kanamycin đƣợc dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR khuẩn lạc 25 µl: PCR mastermix 2X (Promega) 12,5 µl, T7 promoter/ terminator primer (25 µM) 0,25 µl. Chu kỳ nhiệt: 95°C trong 5 phút (1 chu kỳ) ; 94°C trong 30 giây, 50°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây (40 chu kỳ) ; 72°C trong 6 phút (1 chu kỳ).
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Những khuẩn lạc cho sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng base sẽ 205 bp đƣợc chọn để nuôi cấy, tách chiết thu nhận plasmid. Plasmid thu đƣợc từ những dòng vi khuẩn này sẽ đƣợc kiểm tra tiếp bằng phản ứng PCR trên plasmid và bằng các enzyme giới hạn. Phản ứng PCR có thành phần tƣơng tự nhƣ trên trong đó nguyên liệu và mồi đƣợc thay bằng 1 µl DNA plasmid và cặp mồi RoTAT 1.2. Khi điện di trên gel agarose 1%, những khuẩn lạc có kích thƣớc khoảng 205bp là các khuẩn lạc chứa vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pET32/RoTAT 1.2.
2.4.5.9. Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
Nguyên tắc:
Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trƣờng. Các phân tử protein mang điện tích âm sẽ dịch chuyển về phía cực dƣơng của điện trƣờng. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc hình dạng và kích thƣớc của phân tử protein, phân tử có kích thƣớc và khối lƣợng phân tử lớn sẽ chạy chậm hơn những phân tử nhỏ.
Kĩ thuật SDS – PAGE đƣợc dùng trong nghiên cứu enzyme, để xác định phân tử lƣợng protein, hàm lƣợng, độ tinh sạch của protein.
Tiến hành:
- Bƣớc 1. Chuẩn bị gel SDS - PAGE: thành phẩn bản gel trong phần phụ lục. Bản gel gồm có gel phân cắt và gel phân tách protein đƣợc đổ khuôn và tạo các giếng chứa protein
- Bƣớc 3. Nhỏ mẫu: kháng nguyên đƣợc pha loãng ở các nồng độ nồng độ
mercapthoethanol rồi biến tính protein ở 950C/5 phút. Nhỏ 15 – 20 µl mẫu vào mỗi giếng, và 10 µl marker chuẩn trên một giếng.
- Bƣớc 4. Điện di: quá trình điện di thực hiện ở hiệu điện thế 120 V đến khi màu thuốc nhuộm chạy đến chân bản gel tách.
- Bƣớc 5. Nhuộm gel: bản gel đƣợc nhuộm bằng dung dịch Coomassie blue R – 250 0,1% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và có lắc.
- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy trên máy lắc, thay dung dịch tẩy khoảng 2 – 3 lần đến khi thấy các vạch điện di xuất hiện.
2.4.5.10. Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
Là phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể trên màng nitrocellulose. Kháng nguyên sau khi đƣợc điện di trên gel SDS - PAGE sẽ đƣợc gắn lên màng nitrocellulose dƣới tác dụng của dòng điện.
Tiến hành phản ứng:
Bƣớc 1. Điện di kháng nguyên (thực hiện nhƣ mục 2.4.5.9)
Bƣớc 2. Gắn kháng nguyên lên màng nitrocellulose trong buồng điện phân
với dòng điện 100 V qua đêm ở 40C. Lấy màng nitrocellulose, cắt thành các bản
nhỏ có kích thƣớc bằng giếng gel SDS - PAGE.
Bƣớc 3. Phủ màng bằng cách ngâm trong dung dịch PBS sữa tách bơ 6% trong 2h ở nhiệt độ phòng. Bật máy lắc trong khi ngâm. Rửa với PBS - Tween 0,05% 3 lần, mỗi lần 5 phút.
Bƣớc 4. Lai kháng thể: ngâm màng trong dung dịch kháng thể 1 : 200 (trong dung dịch PBS). Thời gian ngâm là 2 h trong nhiệt độ phòng trên máy lắc. Lấy màng ra khỏi dung dịch kháng thể. Rửa màng bằng dung dịch PBS - Tween 0,05% 3 lần, mỗi lần 5 phút.
Bƣớc 5. Phủ kháng thể 2: ủ màng với conjugate (kháng thể đặc hiệu loài có