4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.2.3. Plasmid pCR 2.1
Plasmid PCR 2.1 là vector tách dòng đang đƣợc sử dụng phổ biến, có hiệu
quả cao, với ƣu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector đã
đƣợc cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có một bazơ Timin.
Vector PCR 2.1 có kích thƣớc 3,9 kb, mang điểm khởi đầu tái bản của
plasmid pUC nên có khả năng nhân lên với số lƣợng rất lớn trong tế bào vi khuẩn
E.coli. Vector đƣợc thiết kế có gắn một operon chuyển hóa đƣờng lactoza là
operon- lac. Sau vị trí promoter là đoạn LacZα mã hóa cho 146 axitamin đầu tiên
của enzyme β- galactosidase, là vùng cắt gắn đa vị đƣợc thiết kế trên đoạn này với
17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: EcoR I, hind III, Nsi I, Kpn I, Sac I, BamH I,
Spe I, BstX I, EcoR V, Not I, Ava I, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I. Trong đó, EcoR I
và BstX I có 2 vị trí cắt, các enzyme còn lại chỉ có 1 vị trí cắt. Với vị trí của vùng
cắt đa điểm nhƣ vậy, sản phẩm β- galactosidase có thể đƣợc tạo ra (nếu vector
không đƣợc dính đoạn ADN ngoại lai, khuẩn lạc màu xanh) hoặc không đƣợc tạo ra (nếu vector đƣợc dính đoạn ADN ngoại lai và khuẩn lạc có màu trắng trên môi trƣờng thạch). Dựa vào dấu chuẩn đó, ngƣời ta có thể lựa chọn đƣợc những tế bào mang vector tái tổ hợp với tần suất cao.
Hình 1.1 Vector tách dòng pCR 2.1
Một ƣu điểm nữa của PCR 2.1 là nó mang promoter của thực khuẩn thể T và các vị trí gắn mồi xuôi và ngƣợc của thực khuẩn thể M13, nhờ đó có thể phiên mã đƣợc đoạn RNA antisense và đọc trình tự đoạn ADN
Ngoài ra, vector PCR 2.1 có chứa gen kháng sinh là Amp và Ka, nhờ đó mà có thể sinh trƣởng bình thƣờng trên môi trƣờng có chứa Amp hoặc Ka với nồng độ ức chế tối thiểu.
1.2.4. Vector tách dòng pJET1.2/blunt
Vector tách dòng pJET1.2/blunt đƣợc tách chiết từ dòng tế bào E. coli
DH5α/pJET1.2/blunt và đƣợc cắt mở vòng bằng enzyme Klenow. Đây là vector
tách dòng thế hệ mới của hãng Fermetas có kích thƣớc gần 3kb (2974bp). Trên
vector có gắn gen kháng kháng sinh (bla) nên chỉ có những tế bào có mang vector
này mới có thể sống đƣợc trên môi trƣờng có Ampicilin. Đồng thời trên vector này
tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy, vector khi đƣợc gắn thêm gen ngoại lai sẽ làm mất đi hoạt tính của enzyme này dẫn đến sự không phân hủy ADN của tế bào chủ.
Nhờ có eco47RI mà quá trình chọn lọc plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn.
Hình 1.2 Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT 1.2
Theo thiết kế, vector pJET1.2/blunt có chứa gen mã hóa kháng kháng sinh ampicillin cho phép dễ dàng phát hiện vector tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sự phát triển của các khuẩn lạc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 100μg/ml.