4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.2 Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2
Trong nghiên cứu này, vector pET 32a (+) đƣợc lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng. Với các ƣu điểm là có khả năng tạo số lƣợng lớn bản sao trong tế bào vật chủ, có promoter hoạt động mạnh, có gen kháng kháng sinh là chỉ thị để chọn lọc tế bào chứa plasmide tái tổ hợp, pET 32a (+) đƣợc sử dụng trong quy trình sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp khác nhau
trong biểu hiện ở mức độ cao của các gen ở vi khuẩn E. coli.
Plasmid pJET-RoTAT 1.2 chứa trình tự đoạn gen RoTAT 1.2 sau khi đƣợc tinh sạch đƣợc sử dụng trực tiếp để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen RoTAT 1.2.
Vector biểu hiện đƣợc thiết kế theo sơ đồ thể hiện ở hình 3.11. Gen RoTAT
1.2 và vector pET 32a(+) đƣợc cắt lần lƣợt với enzyme Bam HI, rồi đƣợc điện di và
tinh sạch bằng kit High Pure Product purification kit (Roche). Sau đó, sản phẩm
tinh sạch tiếp tục đƣợc cắt với Xho I. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với
từng enzyme đƣợc trình bày trong bảng 3.4 và 3.5. Sản phẩm xử lý enzyme cuối cùng sẽ đƣợc tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trƣớc khi thực hiện phản ứng ghép nối với nhau. Kết quả điện di thể hiện trong hình 3.12 cho thấy, sản phẩm cắt enzyme của gen RoTAT 1.2 và vector pET 32a(+) xuất hiện 1 băng duy nhất, có kích thƣớc khoảng 0,2 kb và 5,9 kb, tƣơng tự nhƣ kích thƣớc lý thuyết của gen và vector. Kết quả này chứng tỏ, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng hai enzyme
cắt giới hạn Bam HI và Xho I có chất lƣợng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích
Hình 3.10. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen RoTAT1.2
Hình 3.11. Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt bằng các anzyme giới hạn Bam HI và Xho I
M: thang chuẩn 10 kb, 1: sản phẩm cắt gen RoTAT 1.2, 2: sản phẩm cắt vector pET 32a (+)
Bảng 3.4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Bam HI
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện xử lý
H2O 60
Ủ 370
C trong 2 giờ
Đệm 10x 15
pET 32a (+)/ RoTAT 1.2 70
Bam HI 5
Tổng 150
Bảng 3.5. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Xho I
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện xử lý
H2O 33
Ủ 370
C trong 2 giờ
Đệm 10x 10
pET 32a (+)/ RoTAT 1.2 54
XhoI 3
Tổng 100
Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn sẽ đƣợc thôi và tinh sạch bằng kit QIAEX II Gel Extraction Kit của Qiagen sẽ đƣợc ghép nối với nhau nhờ phản ứng nối có thành phần và điều kiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6 Thành phần và điều kiện phản ứng nối gen
Thành phần phản ứng Thể tích(µl) Điều kiện
Đệm 10x 2
Ủ ở 160
C qua đêm
RoTAT 1.2 cắt bằng Bam HI và Xho I 10
pET 32a(+) cắt bằng Bam HI và Xho I 7
T4 ligase 1
Tổng 20
Sản phẩm phản ứng ghép nối gen đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α
Ampicillin với nồng độ 100 μg/ml. Các khuẩn lạc trắng có khả năng chứa vector tái tổ hợp đƣợc lựa chọn để tách chiết plasmide và cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Từ một số khuẩn lạc đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên, chúng tôi đã thu đƣợc plasmide tái tổ hợp đƣợc chứng minh ở hình 3.12.
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme Bam HI và Xho I
M: thang chuẩn 10 kb; 1: Sản phẩm PCR gen RoTAT 1.2; 2: sản phẩm cắt
pET 32a/ RoTAT 1.2 với enzyme Bam HI và Xho I
Kết quả trong hình 3.13 cho thấy: các enzyme giới hạn đã cắt plasmid thành hai băng có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc của gen RoTAT 1.2 và vector pET 32a(+). Để khẳng định gen RoTAT 1.2 đã đƣợc chèn vào vector biểu hiện trên đúng khung và chiều đọc, không xuất hiện lỗi trong quá trình sao chép ADN, vector pET 32a/RoTAT đƣợc tinh sạch để xác định lại trình tự nucleotide và so sánh với trình tự GenBank. Trình tự plasmid tái tổ hợp này chứa đoạn ADN mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 có kích thƣớc khoảng 205 bp và khung dịch mã đƣợc xác định với chuỗi polypeptide chứa đoạn tín hiệu đầu N tƣơng ứng với 68 acid amin. Nhƣ vậy có thể kết luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2.
Plasmid tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3) bằng phƣơng
pháp sốc nhiệt và nuôi cấy trên đĩa LB có chứa kháng sinh ampicillin ở 37oC, qua đêm.
truyền đã đƣợc biến đổi thích hợp cho việc biểu hiện các protein tái tổ hợp từ nhóm vector pET. Chủng này còn mang plasmid pLysS mã hóa cho lyzozyme giúp kiểm soát chặt chẽ hơn việc cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp so với chủng BL21(DE3) thông
thƣờng.Protein RoTAT 1.2 đƣợc biểu hiện ở dạng dung hợp đầu C với đoạn 6xHis. Sự
biểu hiện protein RoTAT 1.2 trong E. coli BL21(DE3) bƣớc đầu đƣợc phân tích bằng
phƣơng pháp SDS-PAGE và tiếp theo là Western blot.
Các dòng tế bào E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT
1.2 thu từ đĩa nuôi cấy rồi tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trƣờng lỏng LB có chứa
ampicilin 100 μg/ml, ở 370C qua đêm đến pha ổn định. Từ dịch nuôi cấy này, vi
khuẩn lại tiếp tục đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh
ampicilin 100 μg/ml, lắc trong khoảng 3 giờ để OD600 đạt từ 0,6 - 1 và bổ sung chất
cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối cùng là 1mM. Điều kiện cảm ứng IPTG là
370C trên máy lắc với tốc độ 200 rpm trong 4 giờ. Đoạn gen mã hoá cho protein
RoTAT 1.2 đƣợc chèn vào vùng MCS của vector pET 32a(+) và sự biểu hiện protein có sự kiểm soát của T7 promoter (hình 3.13). Trên vector pET 32a(+) có
chứa gen lacI mã hoá cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên
promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG. Protein RoTAT 1.2 sẽ đƣợc biểu hiện theo cơ chế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy.
Hình 3.13. Sơ đồ cấu trúc của vector pET 32a(+)
Tế bào vi khuẩn tái tổ hợp sau cảm ứng đƣợc thu nhận, xử lý và điện di trên gel SDS - PAGE 12,5%.
Hình 3.14. Kết quả điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 trên gel SDS-PAGE
(M: thang chuẩn; giếng 1-2: E. coli BL21 - pET32/RoTAT 1.2 cảm ứng với
IPTG; giếng 3-4: E. coli BL21- pET32/ RoTAT 1.2 không cảm ứng với IPTG;
giếng 5: E. coli BL21 - pET32)
So sánh giữa hình ảnh điện di đồ của các mẫu có và không có chất cảm ứng IPTG, đồng thời so sánh kích thƣớc với thang protein chuẩn thấy: các mẫu có cảm ứng với IPTG (đƣờng chạy số 1 - 2) xuất hiện một băng protein mới có kích thƣớc nằm ở khoảng giữa 8kDa (tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của protein RoTAT 1.2 có gắn đuôi His-tag) còn ở mẫu không cảm ứng với IPTG (đƣờng chạy số 3 - 4)
không thấy xuất hiện băng này. Hơn nữa, ở mẫu nuôi E. coli BL21- pET32 cũng
không bổ sung IPTG (đƣờng chạy số 5) không thấy xuất hiện băng protein trên (hình 3.14). Nhƣ vậy, băng protein xuất hiện mới này có nhiều khả năng chính là protein tái tổ hợp đích mà chúng tôi cần biểu hiện.
Để khẳng định chắc chắn khả năng biểu hiện của gen RoTAT 1.2, chúng tôi
tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng T. evansi và kháng
thể đặc hiệu kháng 6xHis. Protein RoTAT 1.2 sau khi đƣợc phân tích trên gel polyacrylamide, chuyển sang màng nitrocellulose rồi cho phản ứng với kháng thể đặc hiệu và sau đó đƣợc gắn với protein A gắn peroxidase, hiện màu bằng TMB.
Kết quả Western blot giữa protein RoTAT 1.2 với kháng th ể kháng đuôi
6xHis và kháng thể kháng T. evansi (hình 3.15, 3.16) cho thấy tín hiệu lai với cả
quả điện di SDS-PAGE. Nhƣ vậy, chúng tôi đã biểu hiện thành công kháng nguyên
RoTAT 1.2 của tiên mao trùng T. evansi ở vi khuẩn E. coli BL21(DE3).
Hình 3.15. Kết quả Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng 6xHis
Vạch 1, 2, 3: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 không cảm ứng IPTG; vạch 4, 5, 6: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 có cảm ứng IPTG
Hình 3.16. Kết quả Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng T. evansi
Vạch 1, 2, 3: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 không cảm ứng IPTG; vạch 4, 5, 6: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 có cảm ứng IPTG.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ