Sử dụng máy đo pH. 3.3.2 Nồng độ chất khô Sử dụng khúc xạ kế để bàn, đơn vị đo là oBx. 3.3.3 Hàm lượng đường khử [4] 3.3.3.1 Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với với thuốc thử 3,5 – dinitrosalicylic acid (thuốc thử DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3–amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
NO2 OH COOH NO2 3C6H12O6 + + 4NaOH NH2 OH COONa NO2 3C5H11COONa + 3H 2O
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng 540 – 600 nm.
3.3.3.2 Hóa chất
Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid
Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1,6g NaOH trong khoảng 60 – 70mL nước cất. Sau đó cho 30g Kali Natri Tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan hoàn toàn.
Chuyển dung dịch trên vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch.
Dung dịch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6- 8oC), dùng tốt nhất trong 15 ngày.
Dung dịch đường chuẩn
Dung dịch đường chuẩn là dung dịch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1 (w:w), có nồng độ là 2g/L.
3.3.3.3 Cách tiến hành
Xử lý mẫu
Vì trong dịch nho có chứa nhiều acid hữu cơ, các chất màu và nhiều tạp chất khác nên ta phải tiến hành xử lý mẫu hợp lý để không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Acid hữu cơ: trung hòa acid trong mẫu bằng dung dịch NaOH 0,1N.
Chất màu và các tạp chất khác: cho dung dịch Ba(OH)2 0,3N và ZnSO4 5% với tỷ lệ 1:1 vào mẫu Ba(OH)2 và ZnSO4 phản ứng với nhau tạo kết tủa, tách các chất màu và các tạp chất khác và làm trong mẫu.
Dựng đường chuẩn
Lần lượt cho 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mL dung dịch chuẩn 2g/L vào 5 ống nghiệm khác nhau.
Sau đó, lần lượt thêm vào các ống nghiệm 2,8; 2,6; 2,4; 2,2 và 2mL nước cất theo đúng thứ tự ống nghiệm như trên.
Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch DNS, lắc đều.
Dùng một miếng nylon sạch bịt kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 5 phút.
Làm nguội nhanh dung dịch, cho thêm 10mL nước cất và lắc đều cho đến khi dung dịch không còn phân lớp.
Đo độ hấp thu A ở bước sóng = 540nm.
Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.
Từ các kết quả đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A).
Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm Pha loãng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu 2g/L.
Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu, 2mL nước cất và 1mL dung dịch DNS, lắc đều. Sau đó tiến hành tương tự như trên.
Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ đường khử có trong mẫu nghiên cứu.
3.3.4 Hàm lượng nitơ amin tự do [4]
Định lượng nitơ amin bằng phương pháp so màu với thuốc thử là ninhydrin.
3.3.4.1 Nguyên tắc
Cơ chế phản ứng: Khi pH lớn hơn 4, các gốc nitơ amin tự do sẽ phản ứng với ninhydrin, tạo phức có màu xanh tím.
O O O R CH NH2 COOH O O OH H NH3 CO2 RCHO + + + + ninhydrin khử ninhydrin O O OH H NH3 O O O O O O O N + + + phức Ruheman (xanh tím) 2H2O 3.3.4.2 Hoá chất
Dung dịch chuẩn glycine: hòa tan 0,1072g glycine và định mức đến 100mL. Bảo quản ở 4oC. Trước khi sử dụng pha loãng dung dịch này 50 lần được dung dịch A.
Hòa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin và 0,3g fructose trong nước và định mức đến 100mL được dung dịch B. Chỉnh pH cuối 6,6 – 6,8. Dung dịch B được bảo quản trong tối ở 4oC, dùng trong 2 tuần.
Hòa tan 1g KIO3 trong 300mL nước cất và 200mL cồn 96% v/v được dung dịch C. Dung dịch C được bảo quản ở 5oC.
3.3.4.3 Cách tiến hành
Pha loãng dịch nho và dịch lên men 50 lần.
Cho 2mL dung dịch đã pha loãng và 1mL dung dịch B vào mỗi 3 ống nghiệm. Đun cách thủy (ở 100oC) trong 16 phút, làm nguội về nhiệt độ 20oC trong bể nước 20oC trong thời gian 20 phút.
Cho tiếp vào ống nghiệm 5mL dung dịch C, lắc đều và đo độ hấp thu ở bước sóng = 570nm trong vòng 30 phút.
Làm 3 mẫu chuẩn song song với 2mL dung dịch A.
Làm mẫu trắng với 2 mL dung dịch nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.
3.3.4.4 Kết quả N = x2x100 A A 2 1 Trong đó:
N: số mg nitơ amin có trong 1L dịch nho cần đo, mg/L A1: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm (giá trị trung bình). A2: độ hấp thu của mẫu chuẩn (giá trị trung bình).
3.3.5 Hàm lượng nitơ ammonium [184]
Xác định nitơ ammonium bằng phương pháp indophenol.
3.3.5.1 Nguyên tắc
Indophenol là hợp chất có màu xanh, được tạo thành bằng phản ứng giữa ammonia, hypochlorite và phenol. Phản ứng này được xúc tác bởi sodium nitroprusside.
3.3.5.2 Hoá chất
Dung dịch phenol: trộn 11mL phenol lỏng ( 89%) và định mức thành 100mL bằng ethanol 95%. Dung dịch này chỉ dùng trong 1 tuần.
Sodium nitroprusside 0,5%w/v: hoà tan 0,5g sodium nitroprusside vào trong 100mL nước. Dung dịch này dùng trong 1 tháng.
Alkaline citrate: hòa tan 200g trisodium citrate và 10g NaOH trong nước cất định mức thành 1L.
Sodium hypochlorite 5%: đây là dung dịch có bán sẵn trên thị trường. Dung dịch này dùng trong 2 tháng.
Dung dịch oxy hóa: trộn 100mL dung dịch alkaline citrate với 25mL sodium hypochlorite. Dung dịch này chỉ dùng trong 1 ngày.
Dung dịch chuẩn N 1g/L: hòa tan 4,7143g (NH4)2HPO4 trong nước cất và định mức thành 1L.
Dung dịch chuẩn N 10mg/L: hút 10mL dung dịch chuẩn N 1g/L và định mức thành 1L.
Từ dung dịch chuẩn N 10mg/L pha loãng thành 5 dung dịch chuẩn: 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.
3.3.5.3 Cách tiến hành
Cho 25mL mẫu vào erlen 50mL, thêm vào đó: 1mL dung dịch phenol
1mL dung dịch sodium nitroprusside 2,5mL dung dịch oxy hóa
Bao erlen bằng màng plastic, để ở nhiệt độ phòng (22 - 27oC) ở nơi có ánh sáng nhẹ trong vòng ít nhất là 1h. Dung dịch bền màu trong vòng 24h.
Dựng đường chuẩn: tiến hành tương tự như trên với các dung dịch chuẩn 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.
Cũng tiến hành tương tự với mẫu nước cất để hiệu chỉnh máy về 0.
3.3.6 Hàm lượng tannin [4]
Xác định hàm lượng tannin bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin – Denis.
3.3.6.1 Nguyên tắc
Tannin bị oxy hóa bởi acid phosphomolybdic tạo thành hợp chất có màu xanh.
3.3.6.2 Hóa chất
Thuốc thử Folin – Denis: cho 100g Na2WO4.2H2O, 20g acid phosphomolybdic và 50mL H3PO4 vào 750mL nước, cho chảy ngược dòng trong 2h, làm nguội, và pha loãng đến 1L.
Dung dịch Natri carbonate bão hòa: cho 35g Na2CO3 khan vào 100mL nước, hòa tan ở 70-80oC, sau đó để nguội qua đêm. Dung dịch quá bão hòa chứa các mầm tinh thể Na2CO3.10H2O. Sau khi kết tinh, lọc tinh thể qua len thủy tinh.
Dung dịch chuẩn acid tannic: 0,1g/L. Hòa tan 0,1g acid tannic trong 1L. Chuẩn bị dung dịch mới cho mỗi lần xác định.
3.3.6.3 Cách tiến hành
Xây dựng đường chuẩn
Sử dụng pipet lấy từ 0-10mL dung dịch chuẩn acid tannic vào bình định mức 100mL chứa 75mL H2O.
Thêm 5mL thuốc thử Folin – Denis và 10mL dung dịch Na2CO3, sau đó định mức tới 100mL bằng nước cất.
Trộn đều hỗn hợp trong 30 phút
Xác định độ hấp thu A ở bước sóng 760nm.
Dựng đường chuẩn độ hấp thu A theo mg acid tannic/100mL.
Đo mẫu
Dùng 1mL mẫu, xác định độ hấp thụ A tương tự như trên.
Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ tannin có trong mẫu nghiên cứu.
3.3.7 Hàm lượng sulfur dioxide [171]
Xác định hàm lượng sulfur dioxide bằng phương pháp Ripper.
3.3.7.1 Nguyên tắc
Sulfur dioxide có trong dung dịch mẫu sẽ bị oxy hóa bởi iodine. Lượng iodine dư tác dụng với tinh bột làm cho dung dịch có màu xanh thẫm.
3.3.7.2 Hóa chất
Dung dịch NaOH 4M (160g/L).
Acid sulfuric 10% (v/v).
Dung dịch tinh bột, 5g/L: Trộn 5g tinh bột với khoảng 500mL nước. Đun sôi khuấy trộn liên tục và giữ trong 10 phút. Thêm 200g NaCl. Làm nguội và tạo thành 1 lít.
Dung dịch iodine 0,025M.
3.3.7.3 Xác định sulfur dioxide tự do
Cho vào bình erlen: 50mL rượu vang. 5mL dung dịch tinh bột. 30mg EDTA.
3mL H2SO4.
Chuẩn độ ngay lập tức với iod 0,025M cho tới khi màu xanh xuất hiện rõ trong 10 đến 15 giây. Ghi n là thể tích iodine sử dụng.
3.3.7.4 Sulfur dioxide dạng liên kết
Thêm 8 mL dung dịch NaOH, lắc một lần và để yên 5 phút. Thêm 10mL acid sulfuric trong khi khuấy trộn mạnh. Chuẩn độ ngay lập tức với dung dịch iodine 0,025M, ghi n’ là thể tích sử dụng.
Thêm 20mL NaOH, khuấy trộn đều rồi để yên 5 phút. Pha loãng với 200mL nước đá lạnh. Thêm 30mL acid sulfuric trong khi khuấy trộn mạnh. Chuẩn độ sulfur dioxide tự do ngay lập tức với iodine 0,025M, và ghi n” là thể tích sử dụng.
3.3.7.5 Kết quả
Hàm lượng mg sulfur dioxide tự do trong một lít rượu vang: 32 x n
Hàm lượng mg sulfur dioxide tổng trên một lít rượu vang: 32 (n + n’ + n”)
3.3.8 Hàm lượng ethanol [4]
3.3.8.1 Tiến hành chưng cất
Cho 20mL mẫu vào bình cất 250mL, ghi lại nhiệt độ.
Thêm vào đó 20mL nước cất.
Bình hứng được đặt trong chậu thủy tinh chứa hỗn hợp nước và đá để làm lạnh.
Đun nhẹ bình cất (để tránh bọt không trào sang bầu bảo hiểm). Tăng nhiệt độ bình cất khi bắt đầu sôi đều.
3.3.8.2 Xác định tỷ trọng của dịch cất
Chuẩn bị bình tỷ trọng
Rửa sạch bình tỷ trọng, tráng 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng etanol 96%, hay 2 lần bằng ete etylic hoặc aceton.
Làm khô ngoài không khí hoặc sấy nhẹ ở 50oC trong 30 phút. Sau đó cân để biết khối lượng bình.
Xác định khối lượng bình và nước cất
Từ từ cho nước cất vào bình tỷ trọng. Rót nhẹ theo thành bình để tránh tạo thành bọt khí. Rót đầy đến miệng bình.
Đậy nút bình tỷ trọng và ngâm trong bể điều nhiệt sao cho mực nước của bể trên vạch mức của bình tỷ trọng.
Sau 30 phút, mở nút và dùng pipette hút bớt nước cất cho đến khi đáy của mặt khum tiếp xúc với vạch mức.
Dùng giấy lọc lau khô bên trong cổ của bình tỷ trọng, nút và ngâm trong nước tại nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút.
Đưa bình tỷ trọng ra khỏi nước.
Rửa bình tỷ trọng bằng bông thấm nước etanol 96% cho hết nước bám ngoài bình. Dùng bông hoặc khăn sạch lau khô bình. Khi lau chỉ cầm ở cổ bình để tránh không gây ra sự thay đổi nhiệt độ của dung dịch trong bình. Tránh không để sợi bông bám lại ở ngoài thành bình.
Để yên trong vòng 15 phút và cân.
Xác định khối lượng bình và rượu
Đổ hết nước ra khỏi bình tỷ trọng, rửa bằng acetone và làm khô trong không khí.
Cho mẫu vào bình tỷ trọng và tiến hành tương tự như đối với nước.
Sau khi cân biết khối lượng rượu và bình.
3.3.8.3 Tính kết quả
Tỷ trọng tương đối của rượu (d) tính theo công thức:
m m m m d 2 1 Trong đó m – khối lượng bình tỷ trọng (g) m1 – khối lượng bình và rượu (g) m2 – khối lượng bình và nước (g)
Biết tỷ trọng tương đối (d) tra bảng sẽ tìm được hàm lượng rượu tính theo phần trăm thể tích tại nhiệt độ khảo sát.
3.3.9 Hàm lượng acid tổng [4]
3.3.9.1 Cách tiến hành
Khử CO2: cho khoảng 25mL mẫu vào 1 erlen nhỏ, gia nhiệt đến bắt đầu sôi và giữ trong 30s, lắc đều và làm lạnh.
Thêm 1mL phenolphtalein vào 200mL nước sôi nóng trong erlen 500mL. Trung hòa đến khi có màu hồng nhạt.
Thêm 10mL mẫu đã khử khí và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N.
3.3.9.2 Kết quả
Hàm lượng acid tổng (g acid tartaric/ 100mL rượu vang) = mL NaOH N 0,075 100/10
3.3.10 Hàm lượng acid dễ bay hơi [171]
3.3.10.1 Cách tiến hành
Lấy chính xác 20mL mẫu cho vào bình định mức, rồi rót vào bình cầu của bộ cất. Dùng khoảng 20mL nước cất tráng sạch bình định mức 2 – 3 lần để chuyển toàn bộ rượu vào bình cầu. Lắp hệ thống chưng cất, hứng dịch cất vào bình định mức trên.
Sau khi chưng cất được 2/3 dung tích bình mức và nhiệt độ hơi cất đạt 100oC thì ngừng cất. Thêm nước cất gần vạch mức, để ở 20oC trong 30 phút. Sau đó thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều.
Lấy 10mL dịch cất cho vào erlen 100mL, thêm 3 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho tới khi có màu hồng bền. Thêm 1mL tinh bột, 5mL acid sulfuric và chuẩn độ với I2 0,02N cho đến khi có màu xanh nhạt.
3.3.10.2 Tính kết quả
Acid dễ bay hơi (g acid acetic /100mL rượu vang) = 0,6 [(mL NaOH N NaOH) – (mL I2 N I2)]
3.3.11 Mật độ tế bào [3]
Đối với nấm men trong dịch lên men: pha loãng mẫu rồi sau đó đếm trên buồng đếm Thoma.
Đối với nấm men cố định: rã hạt bằng dung dịch EDTA 5%, sau đó pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết rồi đếm trên buồng đếm Thoma.
Chương 4: KẾT QUẢ và BAØN LUẬN
4.1 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HAØM LƯỢNG ĐƯỜNG ĐẾN ĐỘNG
HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE
Như chúng ta đã biết, đường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, tác động đến sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp cồn của nấm men. Khi hàm lượng đường càng cao thì nấm men càng bị ức chế.
Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát động học quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate với hàm lượng đường ban đầu là 200, 240, 280, 320 và 360g/L. Chúng tôi bổ sung thêm đường để đạt được các giá trị như trên.
4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men quá trình sinh trưởng của nấm men
Kết quả khảo sát động học quá trình sinh trưởng của nấm men được chúng tôi trình bày trong hình 4.1, hình 4.2 và bảng 4.1. Kết quả cho thấy khi hàm lượng đường ban đầu tăng từ 200 đến 240g/L thì mật độ tế bào nấm men trong dịch lên men tăng và tốc độ sinh trưởng riêng cũng tăng:
Mật độ tế bào nấm men cố định cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 155,13.106 tế bào/mL và 222,5.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men cố định ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,248 và 0,344 h-1.
Mật độ tế bào nấm men tự do cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 164,06.106 tế bào/mL và 240,63.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men tự do ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,458 và 0,764 h-1.
Nhưng nếu hàm lượng đường ban đầu tăng cao hơn nữa (240 – 360g/L) thì mật độ tế bào giảm và tốc độ sinh trưởng riêng cũng giảm. Như vậy, khi môi trường lên men chứa quá nhiều đường, khả năng sinh trưởng của nấm men sẽ bị ức chế. Nguyên nhân là do ảnh