2.2.4.1 Những sự thay đổi về sinh trưởng, hình thái của tế bào nấm men khi cố định trên chất mang
Như chúng ta đã biết, quá trình sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường quanh nó. Khi cố định tế bào, do sự tương tác giữa tế bào – chất mang và giữa các tế bào với nhau mà khả năng sinh trưởng và hình thái của tế bào cũng có một vài biến đổi [73].
Theo một số tác giả, khả năng sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so với nấm men tự do:
Banyopadhyay và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men cố định trên thủy tinh xốp (Controled pore glass) bằng phương pháp hấp phụ. Khả năng sinh trưởng của nấm men tự do và cố định được đánh giá gián tiếp thông qua tốc độ hấp thu O2 và tốc độ sinh CO2. Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm men cố định có hiện tượng giảm khả năng hấp thu O2 và sinh CO2 so với nấm men tự do [16].
Doran và cộng sự (1985) cũng tiến hành khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm
men Saccharomyces cerevisiae cố định trên gelatin. Kết quả thực nghiệm thu được
tương tự như kết quả của Bandyopadhyay và cộng sự (1982). Ngoài ra tác giả còn nhận thấy rằng tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ nảy chồi của nấm men cố định trên gelatin đều thấp hơn so với nấm men tự do [56].
Nguyên nhân của hiện tượng này là do:
Hệ lên men sử dụng nấm men cố định là một hệ phản ứng dị thể, trong đó, các chất dinh dưỡng có xu hướng tập trung trên bề mặt chất mang, vì vậy nấm men hấp phụ trên bề mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao hơn so với trong môi trường đồng thể. Chính sự thay đổi áp lực thẩm thấu một cách đột ngột gây mất cân bằng trao đổi chất qua màng tế bào, làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào [16].
Chồi có thể được hình thành ở bất kỳ vị trí nào trên bề mặt tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisiae, tuy nhiên phổ biến nhất là chồi sẽ mọc ở các cực
ellipsoide của tế bào nấm men lưỡng bội. Vì vậy khi 1 cực của tế bào nấm men gắn vào chất mang sẽ vô tình làm mất đi sự hình thành của một chồi mới [56].
Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rằng nấm men cố định luôn sinh trưởng đạt đến một số lượng tế bào không đổi và giữ nguyên như vậy cho đến khi kết thúc quá trình lên men:
Wada và cộng sự (1980) nhận thấy rằng nấm men cố định sinh trưởng và giữ ổn định ở khoảng 5,4.109 tế bào/mL gel [201].
Melzoch và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sự phát triển và hình thái của nấm men cố định trong gel Ca-alginate. Các tế bào nấm men cố định sau khi được hoạt hóa, nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, số lượng tế bào sẽ tăng
lên rất nhanh (khoảng 1010 tế bào/mL gel) và sau đó hầu như giữ nguyên không đổi [142].
Bên cạnh đó, Melzoch và cộng sự cũng thấy rằng 80% tế bào cố định trong gel alginate đều duy trì hoạt tính trao đổi chất và khả năng phát triển khi nuôi cấy trong thời
gian dài. Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate có thể duy trì khả năng sử
dụng đường của chúng ở mức độ tương đối cao và ổn định, chỉ giảm khoảng 20% sau 1122 giờ nuôi cấy [142].
Hình thái của nấm men cố định cũng thay đổi nhiều so với nấm men tự do:
Banyopadhyay và cộng sự (1982) giả thuyết rằng chính sự mất cân bằng về trao đổi chất làm cho các chồi của nấm men sau khi mọc thành nhanh chóng bị tách ra khỏi tế bào mẹ, làm cho hình thái tế bào nấm men bị thay đổi [16].
Melzoch và cộng sự (1994) khảo sát sự thay đổi hình thái của tế bào nấm men cố định trong gel được tiến hành bằng cách quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Kết quả khảo sát cho thấy tế bào nấm men cố định có hình dạng và kích thước không đồng đều. Điều đó cho thấy sự phát triển của các tế bào bị nhốt trong hạt gel phụ thuộc vào độ xốp và cấu trúc của mạng gel cũng như khả năng chiếm chỗ trống trong hạt gel của tế bào nấm men. Trong chất mang, các tế bào nấm men có xu hướng kết tụ lại với nhau [142].
2.2.4.2 Những thay đổi về hoạt động trao đổi chất của tế bào nấm men khi cố định trên chất mang
Nhiều nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng nấm men cố định có tốc độ sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng hợp ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm men tự do mặc dù diện tích bề mặt tế bào của nấm men cố định dùng để vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏ hơn so với của nấm men tự do (bảng 2.6) [15, 43, 52, 56, 73, 74, 75, 131, 138, 154, 193].
Glazzo và Bailey (1990) giải thích là do quá trình cố định làm thay đổi sự vận chuyển proton qua màng tế bào nấm men (Thể hiện qua giá trị pH nội bào của nấm men cố định hơi thấp hơn một chút so với giá trị pH nội bào của nấm men tự do: giá trị pH nội bào của nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate lần lượt là 6,9 và 6,8). Để duy trì ổn định pH nội bào, nấm men phải tăng tốc độ sử dụng ATP. Như chúng ta đã biết, quá trình sinh tổng hợp ethanol bị hạn chế khi có sự có mặt của ATP. Chính vì vậy, ở nấm men cố định, quá trình sử dụng ATP tăng làm giảm sự có mặt của ATP trong tế bào, kết quả dẫn đến tốc độ sinh tổng hợp ethanol ở tế bào nấm men cố định tăng vọt [74].
Thêm vào đó, Galazzo và cộng sự (1987) cho rằng pH nội bào của tế bào cố định thấp hơn so với tế bào tự do, do đó làm tăng tốc độ của các phản ứng xúc tác bởi phosphofructokinase và hexokinase. Vì thế làm tăng tốc độ lên men [75].
Ngoài ra, nguyên nhân còn có thể là do nấm men cố định đã có những thay đổi trong thành phần tế bào:
Thay đổi hàm lượng các chất trao đổi trung gian như là fructose-1,6-diphosphate, glucsoe-6-phosphate và 3-phosphoglycerate [73].
Hàm lượng polysaccharide tạo cấu trúc (glycogen, mannan, glucan, trehalose), chất dự trữ glycogen, DNA, và RNA cao hơn so với tế bào tự do [38, 71, 73, 96, 113, 138, 150, 193].
Bảng 2.6: Tốc độ sử dụng cơ chất và hình thành sản phẩm của nấm men cố định trong gel alginate
và nấm men tự do [74] Nấm men tự do (mmol/ L/ ph) Nấm men cố định (mmol/ L/ ph) Tốc độ sử dụng glucose Tốc độ sinh tổng hợp ethanol Tốc độ sinh tổng hợp glycerol 21,1 37,1 3,5 42,7 70,0 6,9
Cũng giống như khi nuôi cấy trên môi trường tổng hợp, nấm men cố định khi nuôi cấy trong môi trường dịch nho ép trong lên men rượu vang cũng cho kết quả tương tự.
Kết quả nghiên cứu của Bakoyianis và cộng sự (1997) về quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định trên -alumina, kissiris và alginate cho thấy nấm men cố định có tốc độ sử dụng đường cũng như tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn hẳn nấm men tự do. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khi nhiệt độ giảm, hoạt động trao đổi chất của nấm men cũng giảm. Tuy nhiên, ở bất kỳ trường hợp nào, hoạt động trao đổi chất của nấm men cố định cũng cao hơn nấm men tự do [14].
2.2.4.3 Những thay đổi về khả năng chống lại các yếu tố bất lợi trong môi trường của tế bào nấm men cố định
Lượng cơ chất càng cao hoặc lượng sản phẩm càng cao thì càng ức chế hoạt động sống của tế bào nấm men. Tuy nhiên, so với nấm men tự do thì nấm men cố định có khả năng chịu được sự ức chế cơ chất và sản phẩm cao hơn:
Desimone và cộng sự (2002) đã cho nấm men tiếp xúc với ethanol nồng độ 80% (v/v) trong nhiều khoảng thời gian khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sống sót của nấm men cố định cao hơn rất nhiều so với nấm men tự do. Sau 5 phút tiếp xúc với ethanol, nấm men tự do bị tiêu diệt hoàn toàn, trong khi số lượng nấm men cố định vẫn tương đương với thời điểm ban đầu [53].
Nghiên cứu của Krisch và Szajáni (1997) cho thấy rằng hàm lượng glucose trên 16% (v/v) thì có ảnh hưởng độc đối với các tế bào nấm men tự do. Khi nồng độ cồn đạt 20% thì nấm men tự do không còn tồn tại. Các tế bào nấm men được nhốt trong gel alginate và hấp phụ trên cellulose thì có khả năng sống sót cao hơn nhiều so với nấm men tự do, lần lượt là 72 và 62% [117].
Holcberg và Margalith (1981) cho rằng hàm lượng glucose 40 và 50%w/w sẽ ức chế tế bào tự do, làm cho quá trình lên men hầu như không xảy ra, trong khi đó tế bào cố định vẫn có thể lên men mặc dù tốc độ chậm [91].
Hiện tượng này có thể được giải thích như sau:
Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của hàm lượng cồn cao và ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cao do đường gây ra [12, 113, 117, 133, 150, 206].
Nấm men cố định tạo thành glycerol nhiều hơn. Glycerol có tác dụng làm cân bằng thế oxy hóa khử nội bào của nấm men hoặc sự cân bằng NAD+/NADH và hoạt động như là một chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đối với áp lực thẩm thấu cao của đường trong suốt quá trình lên men. Nhiều tác giả cũng cho rằng khi hàm lượng đường càng tăng thì lượng glycerol tạo thành cũng tăng [15, 43, 52, 60].
Nấm men cố định chứa lượng acid béo no cao hơn so với nấm men tự do, nên làm tăng khả năng chịu nồng độ cồn cao. Mức độ no của acid béo càng tăng sẽ làm tăng khả năng chịu đựng đối với ethanol. Agudo (1992) cũng nhận thấy rằng các giống
Saccharomyces chịu cồn có chỉ số không no thấp hơn so với các chủng ít chịu cồn
[53, 117, 150].
Nấm men cố định có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm tăng khả năng giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường. Nagodawithana và Steinkraus (1976) cho rằng khả năng chịu cồn tùy thuộc vào khả năng tế bào giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206].
Có hoạt tính enzyme ADH (là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa acetaldehyde thành ethanol) cao hơn [59].
Ngoài ra, theo Ladato và cộng sự (1999), nấm men cố định trong các vật liệu khác nhau đều tăng khả năng sống sót và khả năng chịu nhiệt trong điều kiện bảo quản đông và đông khô so với nấm men tự do [113].
2.2.4.4 Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm phụ tạo hương vị cho rượu vang của nấm men cố định
Trong quá trình lên men rượu vang, khả năng sinh tổng hợp sản phẩm phụ tạo hương vị cho rượu vang của nấm men được coi là một trong những tính chất quan trọng nhất. Các chất tạo hương vị cho sản phẩm rượu vang là một tổ hợp bao gồm rất nhiều chất thuộc họ ester, aldehyde, ketone, rượu cao phân tử, acid béo và các hợp chất có chứa lưu huỳnh …. Các chất này được hình thành trong quá trình trao đổi chất của nấm men (Hình 2.9), đặc biệt là từ các quá trình trao đổi acid amine, và nó đặc trưng cho từng loại rượu vang khác nhau. Trong đó, rượu cao phân tử và ester là thành phần chiếm phần lớn khối lượng của các sản phẩm phụ [28, 113, 131, 135].
Ethyl ester của các acid béo cũng như ethyl ester của rượu đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương thơm đặc trưng sản phẩm rượu vang. Ngược lại, rượu cao phân tử và acetaldehyde lại được coi là các yếu tố gây ảnh hưởng không tốt đến mùi vị của sản phẩm [28, 113, 131, 135, 139].
Hình 2.9: Con đường hình thành các chất tạo hương vị cho rượu vang [85]
Quá trình sinh tổng hợp các chất dễ bay hơi tạo hương vị cho rượu vang bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như chủng nấm men, loại nho nguyên liệu, điều kiện lên men…. Quá trình lên men sẽ làm tăng thêm hương vị cho rượu vang bằng cách thúc đẩy quá trình trích ly các hợp chất từ các chất rắn có trong dịch nho, biến đổi một vài hợp chất có trong nho và tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm trao đổi chất của nấm men. Rất nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng nấm men cố định trong lên men rượu vang không những giúp làm tăng năng suất lên men mà nó còn giúp làm tăng chất lượng của rượu vang thành phẩm. Chính sự có mặt của chất mang đã làm thay đổi một số đặc điểm về sinh lý và sinh hóa của nấm men theo hướng tích cực trong suốt quá trình lên men và gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp sản phẩm phụ [28, 131, 132, 133, 134, 135, 193].
Nhìn chung, so với nấm men tự do thì nấm men cố định:
Tạo thành nhiều ester hơn. Do việc cố định các tế bào nấm men có thể làm thay đổi hoạt động của các enzyme acetyl-transferase theo hướng tích cực hơn, do đó làm tăng quá trình tổng hợp ester [20, 56, 113, 131, 133, 135, 193, 208].
Tạo thành ít diacetyl hơn [113].
Tạo thành ít acetaldehyde hơn [193, 196, 208].
Tạo thành ít methanol hơn [196, 208].
Tạo thành ít acid dễ bay hơi hơn [18, 196].
Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu lại cho thấy loại chất mang dùng để cố định nấm men cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các hợp chất dễ bay hơi (Mallouchos và cộng sự, 2003; Kourkoutas và cộng sự, 2005; Bardi và cộng sự, 1997…). Nguyên nhân có sự khác biệt là do cấu trúc của chất mang sẽ gây ảnh hưởng khác nhau đến quá trình trao đổi chất của nấm men.
Nghiên cứu của Mallouchos và cộng sự (2003) về quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định trên DCM và gluten cho thấy loại chất mang có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm phụ trong quá trình lên men rượu vang. Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm men cố định trên DCM có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất ester cao hơn hẳn nấm men cố định trên gluten. Bên cạnh đó, nấm men cố định trên DCM lại cho khả năng sinh tổng hợp rượu cao phân tử nhỏ hơn và khả năng sinh acid lớn hơn nấm men cố định trên gluten [135].
Kết quả nghiên cứu của các tác giả khác cũng cho thấy loại chất mang cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản phẩm phụ của nấm men [107, 113]. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.7.
Bảng 2.7: Các hợp chất hương chính của rượu vang tạo bởi nấm men cố định và nấm men tự do
trong khoảng nhiệt độ 15 – 20oC [113]
Chất mang cố định Ethyl acetate (mg/L) Amyl alcohols (mg/L) Acetaldehyde (mg/L) Propanol – 1 (mg/L) Isobutyl alcohol (mg/L) Methanol (mg/L) Tế bào tự do DCM Gluten Miếng táo Miếng mộc qua Kissiris -alumina Alginate 50 – 80 100 – 115 60 – 170 50 – 120 40 – 100 80 – 140 70 – 110 90 - 130 130 – 160 120 – 150 210 – 360 180 – 300 150 – 290 120 – 150 90 – 130 120 - 140 20 – 25 25 – 30 35 – 80 5 – 40 10 – 30 15 – 30 15 – 50 5 – 20 35 – 50 30 – 40 25 – 60 5 – 20 10 – 25 35 – 50 25 – 40 30 - 40 20 – 35 20 – 30 30 – 50 15 – 30 10 – 25 20 – 30 15 – 25 20 - 50 75 – 90 75 – 95 30 – 90 10 – 90 10 – 40 75 – 110 60 – 105 65 - 100
Khi nghiên cứu về quá trình lên men rượu vang trắng sử dụng nấm men cố định, Yajima và cộng sự (2001) thấy rằng không phải chỉ có loại chất mang mới ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các hợp chất dễ bay hơi của nấm men mà ngay cả khi cố định trên