2.2.3.1 Alginate
Alginate có khá nhiều trong tự nhiên và có thể xuất phát từ 2 nguồn gốc khác nhau [186]:
Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối
lượng chất khô.
Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất.
Tuy nhiên tất cả các alginate thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo.
Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer -D- mannuronic acid (gọi tắt là M) và -L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4 – glucoside. Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block (Hình 2.6) [116, 181, 186]:
Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau
Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau
Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau.
Hình 2.6: Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố
2.2.3.2 Cơ chế tạo gel
Alginate có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khi phân tử alginate bị acid hóa. Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hóa phân tử alginate ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp [186].
Alginate có khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hóa trị cao để tạo thành gel đồng thể. Aùi lực của alginate đối với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+. Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau. Thông thường, người ta thường sử dụng calcium để làm ion tạo gel [144, 181].
Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trị cao có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phương pháp tạo gel từ bên trong [186].
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài
Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate. Phương pháp này có ưu điểm là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản (Hình 2.7).
Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel (thường gặp nhất là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa. Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa. Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong. Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao [100, 186, 193].
Hạt gel Cacium Alginate Na- Alginate Ca Ca Ca Ca Ca Ca CaCl2 Na-Alginate Lực đẩy
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong
Cho các muối có chứa các cation tạo gel ở dạng vô hoạt (Ví dụ: CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, calcium citrate…) vào dung dịch alginate. Thay đổi pH của dung dịch về pH acid bằng các tác nhân acid hóa (Ví dụ: D-glucono--lactone (GDL)). Khi đó, do pH giảm, mà độ hòa tan của các muối chứa các cation tạo gel như ở trên lại phụ thuộc vào pH nên các ion Ca2+ sẽ được giải phóng dần và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate (Hình 2.8). Phương pháp này cho hạt gel có tính đồng thể cao hơn hẳn phương pháp khuếch tán do các ion Ca2+ phân bố đồng đều hơn. Hơn thế nữa, phương pháp này còn có thể tạo gel với các hình dạng khác nhau như mong muốn bằng cách cho dung dịch alginate vào khuôn thích hợp trước khi quá trình tạo gel diễn ra. Trong khi đó, phương pháp tạo gel từ bên ngoài thường chỉ tạo thành các hạt có hình cầu [67, 100, 101, 186].
H2O GDL H+ CO2 HCO3 CaCO3 H+ Ca Ca Ca Na-Alginate
Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong [186]
Theo Anders Johansen và James M. Flink (1986), khi nấm men được cố định theo phương pháp gel từ bên trong, tốc độ lên men cao hơn và độ bền gel không giảm trong suốt quá trình lên men khi so sánh với nấm men được cố định theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài [100, 101].
2.2.3.3 Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trong gel alginate
Ưu điểm
Quá trình cố định dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209].
Điều kiện cố định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất. Do đó, các tế bào cố định không bị mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211].
Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học [176].
Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169, 176, 192].
Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205].
Nhược điểm và cách khắc phục
Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]: Các tế bào nấm men trên và gần bề mặt có khả năng sinh sôi nảy nở chiếm ưu
thế so với các tế bào nằm sau bên trong hạt, do đó có thể làm phá vỡ bề mặt hạt gel và dễ dàng thoát ra khỏi hạt gel, phát triển nhanh chóng trong môi trường dưới dạng các nấm men tự do. Điều này làm cản trở việc đánh giá động học phản ứng của nấm men cố định, đồng thời gây khó khăn cho việc tách nấm men ra khỏi môi trường lên men. Để khắc phục vấn đề này có nhiều cách khác nhau. Cách thứ nhất là sử dụng kỹ thuật tạo màng bao. Trong phương pháp này, các tế bào sẽ được nhốt bên trong một nhân lỏng được bao bọc bởi một lớp mỏng gel alginate. Do đó, các tế bào sẽ có khoảng không nhiều hơn để phát triển bên trong nhân lỏng. Vì thế, mật độ tế bào đạt được cao hơn mà không bị thoát bào ra ngoài. Hơn thế nữa, bằng cách này có thể sử dụng lượng alginate ít hơn. Cách thứ hai là áo nấm men cố định với mạng polymer, có thể thực hiện một bước (bằng cách sử dụng vòi đôi), hoặc hai bước (bằng cách tạo lớp áo polymer sau khi đã tạo hạt nấm men cố định). Đây là phương án rất khả thi vì nó không làm ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cũng như tốc độ sử dụng cơ chất.
Sự giải phóng CO2 bên trong gel làm phá vỡ cấu trúc của gel. Để khắc phục, có thể làm tăng độ xốp của gel alginate bằng cách giảm nồng độ alginate sử dụng, tuy nhiên điều này lại đồng nghĩa với việc làm yếu mạng gel. Vì thế, phải tăng độ bền gel bằng cách áo các hạt alginate xốp này với màng polymer (ví dụ, chitosan), khi đó độ bền của gel này sẽ tương tự với gel sử dụng nồng độ alginate cao.
Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dịch) như phosphate, citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là các ion sodium và magnesium. Sự có mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho các hạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn định và phá vỡ cấu trúc hạt gel. Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên men các chất ổn định gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để ổn định độ bền gel. Hoặc cũng có thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu composite (colloidal silica) [10, 102, 103, 144, 193, 194].
Không bền hóa học trong dung dịch điện phân và dung dịch có pH cao. Để khắc phục điều này, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và có nhiều phương pháp được đưa ra: tạo liên kết của hạt gel với glutaraldehyde (Takata và cộng sự, 1977), với polycations (Birnbaum và cộng sự, 1981) và sấy khô hạt gel (Klein và Wagner,
trong dung dịch điện phân, nhưng rõ ràng là chúng rất phức tạp và tốn nhiều thời gian. Một số tác giả đã đưa ra phương pháp khác là dùng các ion Ba2+ và Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyền thống. Các ion này có ái lực mạnh hơn đối với alginate, vì thế hạt gel barium và strontium alginate bền hơn trong dung dịch điện phân so với hạt gel calcium alginate. Tuy nhiên, các ion này vẫn không được ứng dụng rộng rãi vì độc tính của nó đối với nấm men và với môi trường [144, 183, 192, 193, 194].
2.2.3.4 Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men
Aûnh hưởng của khối lượng phân tử
Anders Johansen và James M. Flink (1986) đã nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử alginate thông qua các thí nghiệm với các loại alginate có độ nhớt khác nhau. Kết quả cho thấy rằng khối lượng phân tử ít có ảnh hưởng đến tốc độ lên men và sự tạo thành ethanol, mặc dù tốc độ lên men nhìn chung giảm khi tăng khối lượng phân tử. Trong khi đó, độ bền gel (được đo bằng khả năng chống chịu đối với lực nén ép) tăng đáng kể khi tăng độ nhớt từ 5 đến 70cP (độ nhớt là đại lượng đặc trưng cho khối lượng phân tử của alginate), nhưng khi độ nhớt tăng cao hơn nữa (250 đến 600cP) thì độ bền gel tăng rất ít [101].
Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ nhớt đến khả năng khuếch tán của glucose và kết quả cho thấy rằng khả năng khuếch tán của glucose không phụ thuộc vào độ nhớt. Trong quá trình xử lý nhiệt, độ nhớt của alginate giảm do giảm mức độ polymer hóa của các phân tử alginate. Như vậy, việc tiệt trùng alginate không ảnh hưởng bất lợi đến khả năng khuếch tán của glucose [210].
Aûnh hưởng của tỷ lệ G/M
Tỷ lệ G/M là phần mol của L-guluronic acid trên D-mannuronic acid, biểu thị thành phần của alginate.
Khi tỷ lệ G/M giảm thì:
Tốc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể [101].
Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trị 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiên liên kết vào block G hơn là block M và block MG. Do đó alginate có hàm lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thời gian dài. Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ không bị phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn. Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của tế bào nấm men sau khi cố định. Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn và dễ bị rã ra hơn so với các gel giàu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193]. Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợp để cố định nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch tán của glucose và có độ bền cơ học cao hơn [210].
Aûnh hưởng của nồng độ alginate
Tăng nồng độ alginate trong khoảng 1 – 10% làm giảm đáng kể tốc độ lên men và tốc độ sinh tổng hợp cồn do làm giảm sự khuếch tán nhưng lại làm tăng độ bền gel [101, 146, 205, 210].
Theo nhiều nhà nghiên cứu, nồng độ alginate thích hợp để cố định nấm men là 2% [101, 146, 210].
Aûnh hưởng của pH tạo gel
Theo Kazuaki và cộng sự (1995), pH của dung dịch alginate thích hợp cho quá trình tạo gel là từ 6,0 đến 8,0. Nằm ngoài khoảng này, khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel đều giảm. Đó là do pH đã làm thay đổi hình dạng của các phân tử alginate [210].
Aûnh hưởng của nhiệt độ tạo gel
Theo Kazuaki và cộng sự (1995), khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, khả năng khuếch tán của glucose gần như không đổi, nhưng khi tăng nhiệt độ trên 300K thì khả năng khuếch tán của glucose giảm nhanh. Độ bền gel cũng gần như không đổi khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, nhưng giảm nhanh khi tăng nhiệt độ trên 300K. Nhiệt độ tạo gel ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel là do nhiệt độ đã làm thay đổi hình dạng của phân tử alginate. Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo gel là nhiệt độ dưới 298K [210].
Aûnh hưởng của mật độ tế bào trong hạt
Để đánh giá ảnh hưởng của mật độ tế bào, Anders Johansen và James M. Flink (1986) đã tiến hành thí nghiệm với 2 mật độ tế bào là 0,5% và 10% (tương ứng với 2.108 và 4.109 tế bào/ g gel). Kết quả cho thấy rằng khi mật độ tế bào ban đầu cao, tốc độ lên men/ g hạt thì cao hơn nhưng năng suất/ tế bào thì thấp hơn so với mật độ tế bào ban đầu thấp. Đó là do sự có mặt của lớp bề mặt tế bào hoạt hóa ngay sát bề mặt hạt gel, tương tự như với nghiên cứu của Wada và cộng sự (1979) đối với các hạt -carrageenan. Lớp tế bào này làm ngăn cản sự khuếch tán của cơ chất và/ hoặc sản phẩm xuyên qua mạng gel, và do đó các tế bào bên trong gần như bị bất hoạt. Trong trường hợp này, năng suất/ tế bào thấp khi mật độ tế bào cao đó là do các tế bào nằm ở bên dưới lớp bề mặt cũng được tính vào mật độ tế bào nhưng không tham gia vào quá trình tạo thành sản phẩm [101].
Aûnh hưởng của tỷ lệ S/V
Diện tích bề mặt riêng (diện tích bề mặt/ thể tích) là một yếu tố quan trọng đối với năng suất lên men/g hạt, khi tỷ lệ S/V càng cao thì năng suất càng cao. Đối với một tỷ lệ S/V nhất định, hình dạng gel không ảnh hưởng đến tốc độ lên men [101].
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});