2.1.2.1. Hóa chất: + Cồn 96o + Cồn tuyệt đối + Axeton + Ete dầu mỏ + Na2SO4 khan + NaOH + Nước cất
Tất cả hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích
2.1.2.2. Dụng cụ + Ống nghiệm + Ống nghiệm + Bình tam giác 250 ml + Bình định mức 100 ml, 500 ml + Cốc thủy tinh 500 ml, 250 ml, 100 ml + Pipet 1 ml, 10 ml
+ Phễu thủy tinh + Giấy lọc, giấy nhôm
2.1.3. Thiết bị
+ Quang kế UV-Vis Genesys 20 (Thermo Fisher Scientific, USA) + Bể siêu âm Elmasonic S 300H tần số 35 kHz (Elma, Đức)
+ Bộ Soxhlet
+ Thiết bị cô chân không IKA RV 10 Control (IKA, Đức) + Bể làm lạnh tuần hoàn VS-1902 WF (Vision, Korea)
+ Cân phân tích điện tử SATORIUS (Nhật) chính xác 10-4 g + Bình khí N2
+ Thiết bị sấy lạnh
+ Tủ sấy 10C Memmert (Đức) + Tủ lạnh
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xử lý nguyên liệu: 2.2.1 Xử lý nguyên liệu:
Để thuận tiện cho việc bảo quản nguyên liệu và quá trình chiết carotenoit về sau, ớt tươi nguyên liệu được xử lý để chuyển thành dạng ớt bột khô. Nếu chưa kịp xử lý ngay thì bảo quản nguyên liệu tươi trong tủ lạnh ở 40C trong thời gian không quá 1 ngày.
Dựa theo các tài liệu thu thập được [12] chúng tôi tiến hành xử lý nguyên liệu ớt tươi thành bột khô như sau:
Ớt mua về được rửa sạch bằng nước cất, để ráo sau đó tách riêng các phần không sử dụng (cuống, ruột và hạt) và phần sử dụng (phần thịt quả). Phần thịt quả ớt được cắt thành từng sợi dài (dọc theo chiều dài quả) có bề rộng khoảng 0,5 cm, sau đó đem ngâm vào dung dịch NaOH 10% (w/v) trong 30 phút để loại bỏ phần chất cay có trong ớt. Rửa lại ớt sợi nguyên liệu nhiều lần bằng nước cất cho sạch hết NaOH (khoảng 3 đến 4 lần; kiểm tra pH của nước rửa thấy pH = 7 là được). Cuối cùng, nguyên liệu được vớt ra, để ráo ở
nhiệt độ phòng rồi sấy ở 60o
C đến lúc vừa khô, giòn (khoảng 5 h). Ớt sau khi xử lý được đem đi nghiền thành bột mịn, bảo quản trong lọ kín để ở -200
C cho đến khi nghiên cứu.
2.2.2. Xác định thành phần khối lƣợng của ớt nguyên liệu
Các phần sử dụng (thịt quả) và phần không sử dụng (cuống, ruột và hạt) của ớt nguyên liệu sau khi tách riêng được đem cân.
Thành phần khối lượng của ớt nguyên liệu được tính bằng công thức:
Phần sử dụng (%) = 0 1 m m *100% Phần không sử dụng (%) = 0 2 m m *100% trong đó:
m0: khối lượng ớt nguyên liệu ban đầu m1: khối lượng phần thịt quả
m2: tổng khối lượng phần cuống, hạt và ruột
2.2.3. Phƣơng pháp xác định một số thành phần hóa học của nguyên liệu
2.2.3.1. Xác định hàm lượng nước trong ớt tươi và ớt bột nguyên liệu: Sấy ở 105 – 1100C đến khối lượng không đổi (Phụ lục 1) liệu: Sấy ở 105 – 1100C đến khối lượng không đổi (Phụ lục 1)
2.2.3.2. Xác định hàm lượng carotenoit tổng số trong ớt bột nguyên liệu: Chiết carotenoit trong nguyên liệu bằng axeton rồi đo độ hấp thụ của liệu: Chiết carotenoit trong nguyên liệu bằng axeton rồi đo độ hấp thụ của dung dịch ở 460 nm, sử dụng axeton làm dung dịch so sánh (Phụ lục 2).
2.2.4. Xây dựng quy trình chiết xuất carotenoit từ ớt bột
2.2.4.1. Quy trình dự kiến chiết xuất carotenoit từ ớt bột:
Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi dự kiến quy trình chiết xuất carotenoit từ ớt bột nguyên liệu như sau:
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình dự kiến chiết xuất chất màu carotenoit từ ớt bột nguyên liệu
Giải thích quy trình:
Chiết carotenoit : tiến hành chiết carotenoit nghiên cứu các phương pháp chiết như phương pháp ngâm chiết, phương pháp siêu âm và phương pháp Soxhlet, nghiên cứu xác định dung môi chiết, thời gian chiết, tỉ lệ chiết, số lần chiết thích hợp.
Chiết carotenoit
Dịch chiết carotenoit
Cô chân không
Tinh chế sơ bộ
Ớt bột nguyên liệu
Sản phẩm
- Dung môi ?
- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ? - Thời gian chiết ?
- Số lần chiết ? - Phương pháp chiết ?
Dịch chiết carotenoit cô đặc (Oleoresin ớt)
- Dung môi : aceton, cồn tuyệt đối, cồn 960, ete dầu mỏ. - Thời gian chiết :
Phương pháp siêu âm : 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút.
Phương pháp ngâm chiết : 2h, 4h,8h, 10h, 12h. - Tỉ lệ chiết: 10/1, 20/1, 30/1, 40/1, 50/1.
- Số lần chiết : 5 lần đối với phương pháp siêu âm và 4 lần đối với phương pháp ngâm chiết.
Cô chân không dịch chiết carotenoit: mục đích để đuổi dung môi có trong dung dịch chiết để được dịch chiết cô đặc và đồng thời thu hồi được dung môi.
Tinh chế sơ bộ : tiến hành tinh chế để thu được carotenoit tinh chất.
Để chọn điều kiện thích hợp cho việc chiết xuất carotenoit từ ớt nguyên liệu, chúng tôi khảo sát sự thay đổi hiệu suất chiết carotenoit theo các yếu tố sau:
- Dung môi chiết
- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu - Thời gian chiết
- Số lần chiết
Trong nghiên cứu này sử dụng các phương pháp chiết khác nhau: chiết nhờ siêu âm, ngâm chiết và chiết bằng Soxhlet. Phương pháp chiết được chọn dựa trên việc so sánh hiệu suất chiết và các yếu tố khác (thời gian, chi phí, khả năng áp dụng trong thực tế,…)
2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình chiết carotenoit từ ớt bột :
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi chiết thích hợp Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,1 g ớt bột cho vào 4 ống nghiệm. Cho vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung môi (cồn tuyệt đối, cồn 96o, axeton, ete dầu mỏ). Bịt kín miệng ống nghiệm. Tiến hành chiết carotenoit bằng cách siêu âm trong 5 phút ở 30oC. Lọc lấy dịch chiết thu được. Lấy chính xác
Ớt bột Cân (0,1 g) 5 mL cồn tuyệt đối 5 mL cồn 960 5 mL axeton 5 mL eter dầu mỏ
Siêu âm (300C, 5 min)
Lọc
Pha loãng 50 lần Đo quang Axeton
Dịch lọc
Đánh giá hiệu suất chiết
0,1 ml dịch chiết, pha loãng thành 5 ml bằng axeton. Đo độ hấp thụ của các dung dịch thu được ở 460nm với cuvet 1 cm (dùng axeton làm dung dịch so sánh). Xác định hiệu suất chiết carotenoit bằng công thức:
Hiệu suất chiết (%) = (M /M0).100%
trong đó:
M0: lượng carotenoit tổng số trong nguyên liệu, xác định bằng phương pháp đo quang (phụ lục 2)
M: lượng carotenoit chiết được
G d E D V A M cm. . 10 . . . % 1 1 4
A: độ hấp thụ của dung dịch đo được V: thể tích dung môi dùng để chiết D: hệ số pha loãng (D = 50)
% 1 1cm
E là hệ số hấp thụ trung bình của dung dịch carotenoit 1% (w/v) đo với cuvet 1 cm ở 460 nm ( 1% 2300
1cm
E )
d: chiều dày cuvet (d =1 cm)
G: trọng lượng khô tuyệt đối của mẫu (g)
b) Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,1 g ớt bột cho vào 5 ống nghiệm. Thêm lần lượt vào các ống nghiệm dung môi thích hợp đã chọn, trong đó tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thay đổi lần lượt là: 10/1, 20/1, 30/1, 40/1, 50/1 (v/w). Tiến hành chiết carotenoit, pha loãng, đo độ hấp thụ của các dung dịch thu được và tính hiệu suất chiết tương tự như thi nghiệm trên. Từ đó, chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp.
Hình 2.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi /nguyên liệu Ớt bột (0,1 g)
Dung môi thích hợp
Siêu âm (300C, 5 min)
Lọc
Pha loãng 50 lần Đo quang Axeton
Dịch lọc
Đánh giá hiệu suất chiết
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp
10/1 20/1 30/1 40/1 50/1 Thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
c) Xác định điều kiện chiết bằng phương pháp siêu âm
* Xác định thời gian chiết:
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,1 g ớt bột cho vào 6 ống nghiệm. Tiến hành chiết carotenoit bằng phương pháp siêu âm tương tự các thí nghiệm trước, trong đó:
- Sử dụng dung môi và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp đã chọn - Thời gian siêu âm thay đổi lần lượt là: 5; 10; 15; 20; 25; 30 (phút).
Tính hiệu suất chiết carotenoit thu được ở mỗi mẫu. Từ đó, chọn thời gian siêu âm thích hợp.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian siêu âm thích hợp Ớt bột - Dung môi thích hợp - Tỷ lệ D.Môi/N.liệu thích hợp Lọc Pha loãng 50 lần Đo quang Axeton Dịch lọc
Đánh giá hiệu suất chiết
Thời gian siêu âm thích hợp
Siêu âm (300C)
10 phút 15 phút 20 phút 25 phút 30 phút 5 phút
* Xác định số lần chiết bằng phương pháp siêu âm:
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,1 g ớt bột cho vào 5 ống nghiệm. Tiến hành chiết carotenoit bằng phương pháp siêu âm tương tự các thí nghiệm trước, trong đó:
- sử dụng dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, thời gian siêu âm thích hợp đã chọn
- số lần chiết thay đổi lần lượt là: 1; 2; 3; 4; 5 (lần).
Tính hiệu suất chiết carotenoit thu được ở mỗi mẫu. Từ đó, chọn số lần chiết thích hợp.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần chiết bằng phƣơng pháp siêu âm
Ớt bột - Dung môi thích hợp - Tỷ lệ D.Môi/N.liệu thích hợp
Lọc
Pha loãng 50 lần Đo quang Axeton
Dịch lọc
Đánh giá hiệu suất chiết
Số lần chiết thích hợp
Siêu âm (300C; thời gian thích hợp)
Chiết 2 lần Chiết 3 lần Chiết 4 lần Chiết 5 lần Chiết 1 lần
d) Xác định điều kiện chiết bằng phương pháp ngâm chiết
Bố trí các lô thí nghiệm xác định thời gian chiết và số lần chiết tương tương tự như phương pháp chiết bằng siêu âm nhưng trong đó:
Tiến hành chiết bằng phương pháp ngâm chiết
Thời gian ngâm chiết thay đổi lần lượt là 2; 4; 6; 8; 10; 12 (giờ) Số lần chiết thay đổi từ lần lượt là; 1; 2; 3; 4 (lần)
e) Xác định điều kiện chiết bằng phương pháp Soxhlet
Tiến hành: Cân chính xác một lượng mẫu ớt bột, gói kỹ bằng giấy lọc rồi cho vào ống chiết của thiết bị Soxhlet (Tỷ lệ thể tích của ống chiết và lượng mẫu tương ứng với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp đã chọn). Cho dung môi thích hợp vào bình cầu (thể tích dung môi khoảng bằng 1/2 thể tích bình cầu). Lắp các bộ phận của thiết bị Soxhlet (bảo đảm hệ thống phải kín). Cho nước chảy qua sinh hàn hồi lưu. Để tránh sự phân hủy carotenoit, hệ thống Soxhlet được che chắn ánh sáng và chỉ đun nóng bình cầu ở nhiệt độ thấp nhất có thể được (ứng với nhiệt độ sôi của dung môi sử dụng). Tiến hành đun cho đến khi dịch chiết trong ống chiết gần như không màu. Theo dõi quá trình chiết và ghi lại các thông số nhiệt độ, thời gian của một lần chiết và số lần chiết.
Sau khi kết thúc quá trình chiết, dịch carotenoit trong bình cầu được định mức đến thể tích chính xác, pha loãng (hệ số pha loãng thích hợp) rồi đo độ hấp thụ ở 460 nm. Từ đó, xác định hiệu suất chiết carotenoit.
2.2.5. Đề xuất quy trình thích hợp chiết carotenoit từ ớt:
Sau khi xác định được điều kiện thích hợp để chiết carotenoit từ ớt bột bằng các phương pháp siêu âm, ngâm chiết và phương pháp Soxhlet, tiến hành chiết thử nghiệm trong các điểu kiện trên. So sánh ưu-nhược điểm của các phương pháp chiết nói trên. Từ đó, đề xuất quy trình chiết thích hợp nhất.
2.2.6. Thử nghiệm quy trình chiết - Đánh giá chất lƣợng sản phẩm
Tiến hành chiết thử nghiệm carotenoit bằng quy trình chiết thích hợp đã lựa chọn.
Phân tích các chỉ tiêu cơ bản sau đây để đánh giá chất lượng sản phẩm oleoresin thu được:
- Xác định hàm lượng carotenoit tổng số trong sản phẩm: dùng phương
pháp đo quang UV-Vis (xem phụ lục 2)
- Xác định dư lượng Pb: sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ
nguyên tử (xem phụ lục 3)
- Xác định dư lượng dung môi (axeton, ete dầu mỏ): phương pháp sắc ký khí với detector FID (phụ lục 4).
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần. Kết quả thu được là trung bình cộng của 3 lần xác định nói trên.
Sử dụng phần mềm MS Excel 2003 để tính toán, xử lý số liệu và vẽ đồ thị.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thành phần khối lƣợng của ớt tƣơi nguyên liệu
Kết quả xác định thành phần khối lượng và hàm lượng carotenoit tổng số của ớt nguyên liệu được trình bày trong lần lượt trong các bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1.Thành phần khối lƣợng của ớt sừng Cayenne tƣơi Thành phần Khối lƣợng (%)
Phần sử dụng 75,0
Phần không sử dụng 25,0
Bảng 3.2. Một vài thành phần hóa học cơ bản của ớt nguyên liệu
Thành phần Thịt quả ớt tƣơi Ớt bột Tính theo trọng lượng ướt Tính theo trọng lượng khô Tính theo trọng lượng ướt Tính theo trọng lượng khô H2O (%) 87,7 12,3 7,1 92,9 Carotenoit tổng số (mg/kg) 1.205 9.797 9.101 9.797
Kết quả trên cho thấy:
- Nguyên liệu ớt sừng Cayenne (Capsicum annuum L.) của Việt Nam có thành phần sử dụng (vỏ và thịt quả) chiếm tỷ lệ khá lớn (chiếm 75% tổng khối lượng nguyên liệu). Mặc dù so với giống ớt chuông thường được sử dụng để chiết carotenoit (có tỷ lệ phần sử dụng khoảng 80 – 88% [15]), tỷ lệ này ở giống ớt sừng thấp hơn nhưng bù lại giá ớt sừng (khoảng 5.000 đồng/kg) thấp hơn nhiều khá nhiều so với giá ớt chuông (khoảng 30.000 đồng/kg.
Ngoài ra, kết quả phân tích (bảng 3.2 ) cho thấy loại ớt đang sử dụng có hàm lượng carotenoit tổng số của khá cao, lên đến 9797 mg/kg trọng lượng khô (theo một số tài liệu công bố [16], [17] thì những giống ớt có hàm lượng carotenoit cao nhất vào khoảng 8797 – 13.208 mg/kg trọng lượng khô). Do vậy, loại ớt sừng Việt Nam có thể xem là nguồn carotenoit tự nhiên có nhiều tiềm năng cần được khai thác sử dụng.
- Thành phần không sử dụng cho mục đích chiết carotenoit (bao gồm cuống, hạt, lõi) chiếm một lượng nhỏ (25%), trong đó phần hạt và lõi ớt có thể được tận dụng để chiết capsaicin - đây là chất cay trong ớt được ứng dụng để tạo vị cay cho một số thực phẩm đồng thời cũng được ứng dụng trong y dược làm tác nhân diệt khuẩn, chống ung thư,...
3.2. Chọn điều kiện thích hợp để chiết carotenoit từ ớt bột nguyên liệu
3.2.1. Chọn dung môi chiết
Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết
11,6 22,6 73,2 58,5 0 20 40 60 80 100 Cồn 96o Cồn tuyệt đối
Axeton Ete dầu mỏ
Dung môi H iệ u s uất c hi ết (%)
Hiệu suất chiết carotenoit phụ thuộc nhiều vào dung môi chiết. Thực vậy, đồ thị 3.1. và bảng PL 6.1 cho thấy: axeton là dung môi chiết cho hiệu suất cao nhất, sau đó là ete dầu mỏ, tiếp đến là cồn tuyệt đối và thấp nhất là cồn 960. Như vậy, nhìn chung dung môi càng phân cực thì khả năng chiết các carotneoit càng kém. Tuy nhiên, ete dầu mỏ có độ phân cực thấp hơn axeton lẽ ra phải có khả năng chiết carotenoit chiết tốt hơn nhưng kết quả phân tích lại cho thấy ngược lại. Điều này có lẽ là do các phân tử hydrocarbon trong hỗn hợp ete dầu mỏ có kích thước lớn hơn kích thước phân tử axeton nên khả năng thâm nhập vào cấu trúc nguyên liệu chiết khó khăn hơn.
Như vậy, dung môi chiết carotenoit từ nguyên liệu ớt bột thích hợp nhất là axeton. Do đó, axeton được chọn làm dung môi chiết cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Từ đồ thị 3.2 và bảng PL 6.2 ta thấy:
Nhìn chung, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tăng thì hiệu suất chiết cũng tăng. Tuy nhiên, mức độ thay đổi hiệu suất chiết không giống nhau trong những khoảng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu khác nhau: hiệu suất chiết tăng lên đáng kể khi tăng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu từ 10/1 lên 30/1 (v/w) nhưng khi tỷ lệ này vượt quá 40/1 (v/w) thì hiệu suất chiết tăng rất chậm.
Như vậy, để có được hiệu suất chiết cao mà đỡ tốn chi phí cho dung môi ta chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 30/1 (v/w).
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất chiết
33,7