II.1. Đối tượng và địa điểm thu mẫu:
Các loài ốc cối thu được tại vùng biển thuộc Đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam), vịnh Vân Phong (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên).
Ốc cối sau khi thu được giữ trong nitơ lỏng và trong cồn tuyệt đối (để thử nghiệm phương pháp bảo quản), vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm, phân loại và lưu
giữ ở -700C cho các phân tích tiếp theo. Thời gian thu mẫu từ năm 2008-2010. Địa điểm thu mẫu được mô tả ở hình 2.1.
Các loài ốc cối thu được tại vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam: Conus
textile, Conus striatus, Conus vexillum, Conus capitaneus, Conus miles, Conus litteratus, Conus caracteristicus, Conus distans, Conus quercinus, Conus magus, Conus arenatus, Conus tessulatus, Conus marmoreus,Conus lividus, Conus generalis, Conus bandanus, Conus betulinus, Conus imperalis, Conus varius, Conus lynceus, Conus mustelius, Conus leopadus, Conus achatinus, Conus terebra
và Conus cf.distans.
Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu ốc cối Conus spp. (chữ đỏ).
II.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 2.2: Quy trình bố trí thí nghiệm. WIZARD SV Genomic DNA Purification (Promega)
Chạy PCR gen 16S mtDNA
Giải trình tự gen thu được
Xử lý số liệu và xây dựng cây
phát sinh loài Tách chiết DNA tổng số
Mô tả đặc điểm hình thái Mẫu ốc
Điện di kiểm tra DNA tổng số
Thiết bị PCR
II.3. Mô tả đặc điểm hình thái:
Để mô tả đặc điểm hình thái của các loài ốc cối thu thập được tôi tiến hành chọn trong mỗi loài nhiều con có kích thước khối lượng khác nhau làm mẫu nghiên cứu. Mẫu ốc được rửa sạch bằng nước và đặt lên khay đá để làm ráo. Dùng thước chia độ đo (cm và mm) để đo chiều dài, chiều rộng, chiều dài tháp vỏ của mẫu (hình 2.3). Dùng cân kỹ thuật để cân khối lượng từng mẫu. Chụp ảnh và quan sát số lượng đường xoắn ốc, đường suture, màu sắc và hoa văn. Ốc được định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo Röckel và cs (1995) và Nguyễn Ngọc Thạch (2007).
II.4. Tách chiết DNA.
DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể ốc cối (thu trực tiếp ngoài biển, giữ trong ni tơ lỏng, sau đó được bảo quản ở -700C) bằng bộ kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất
II.4.1. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System
- Cắt một mảnh nhỏ chừng khoảng 0,2 cm2 mẫu mô cơ, rửa sạch bằng nước cất rồi cho vào các ống Eppendorf 1,5ml đã khử trùng.
- Sau đó thêm vào 275µl dung dịch phá tế bào (Digestion Solution Master Mix) vào mỗi ống.
- Ủống mẫu qua đêm trên các block nhiệt ở 550C.
- Thêm 250µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống, sau đó đem vortex nhẹ.
- Hút phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1.5ml).
- Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút.
- Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mới - Thêm vào 650µl dung dịch rửa (Wizard SV Wash Solution).
- Ly tâm 13000 vòng 2 phút, loại bỏ phần dung dịch rửa thu được. Lặp lại bước rửa này thêm 1 lần nữa.
- Chuyển cột Wizard SV minicolumn sang một Eppendorf 1,5 ml mới, sau đó
thêm vào 50µl nước sạch nuclease và ủở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
- Dịch chứa DNA hòa tan được thu nhận bằng ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút. Thêm tiếp 50µl nước sạch nuclease và lặp lại bước trên thêm 1 lần nữa. Cột Wizard SV Minicolumn được loại bỏ.
- Dịch chiết DNA được bảo quản ở -400C cho đến khi sử dụng.
Kết quả tách chiết được điện di trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium
bromide. Hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-
rad) được sử dụng để kiểm tra kết quả của quá trình tách chiết DNA tổng số.
II.4.2. Chuẩn bị gel agarose
Cân 0.4g agarose cho vào bình tam giác chứa 40 ml TBE 0.5X. Đun sôi cách
thủy cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Trong quá trình đun cần lắc đều bình cho thạch tan hết.
Thêm vào bình 2 l ethidium bromide, lắc nhẹ bình tránh tạo bọt để trộn đều
ethidium bromide vào thạch (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi sử
dụng hóa chất này).
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược 16 giếng vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn. Để thạch nguội và đông đặc ở nhiệt độ phòng. Khi thạch đặc thì gỡ lược.
Đặt thạch vào trong máng điện di, đổ dung dịch TBE 0.5X cho ngập măt thạch.
II.4.3. Điện di và đọc kết quả
Chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 2 µl Loading Buffer vào 8 µl mẫu thử, trộn đều
rồi cho vào giếng điện di.
Cho 12-15 µl dịch DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng.
Chạy điện di trong 20-30 phút ở dòng điện 100V.
Sau khi chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 3 cm) lấy khuôn
ra khỏi máng và đẩy gel lên bàn UV.
Xem các band DNA dưới tia sáng của đèn cực tím. Kết quả sẽ được ghi nhận
thông qua phần mềm Quantity One.
II.5. Phản ứng PCR.
II.5.1. Cơ sở lý thuyết:
Phản ứng chuỗi nhờ polymerase (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 nhằm khuếch đại một đoạn DNA đích thành hàng tỷ bản sao để sau đó có thể phát hiện được nhờ vào sự sao chép của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Để enzyme DNA polymerase có thể hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Việc khuếch đại các bản sao của phản ứng PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mỗi chu kỳ được chia làm 3 bước, mỗi bước kéo dài khoảng vài chục giây đến vài phút.
Hình 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR.
(http://www.mun.ca/biology/scarr/PCR_simplified.html/)
Giai đoạn biến tính: Nhiệt độđược tăng lên 94-96°C, làm phá vỡ các liên kết hydrogen để tách hai sợi DNA ra. Giai đoạn này kéo dài 1-2 phút.
Giai đoạn gắn mồi lai: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống nhiệt độ bắp cặp của mồi, vào khoảng 45-600C, để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn.
Giai đoạn tổng hợp: Giai đoạn này nhiệt độ được tăng lên 720C, enzyme DNA polymerase hoạt động, kéo dài sợi DNA mới.
Mỗi chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số
nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bãn mẫu
ban đầu.
II.5.2: Tiến hành thực nghiệm:
Sau khi tách chiết, 2µl dịch tách chiết được dùng cho phản ứng PCR để
khuếch đại đoạn gen 16S mtDNA (16S DNA ti thể). Trình tự các đoạn mồi được
trình bày ở bảng 2.1. Biến tính DNA Bắt cặp mồi 50-700C Tổng hợp 720C >900C
Bảng 2.1: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR
Gen Mồi xuôi Mồi ngược Nguồn
16S mtDNA 16SF 5-′CCGGTCTGAACT CAGATCACG T-3′ 16SR 5′-GTTTACCAA AAACATGGCTTC - 3′ Espiritu và cs, 2001
Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 50µl (gồm 2µ khuôn DNA, 5 µl
Taq buffer 1X, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 2 µM mỗi mồi (10mM), 2mM MgCl2, 1
đơn vị Taq polymerase (5U/1µl) và H20 cho đủ thể tích). Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Biroad) theo chương trình nhiệt độ:
Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút.
35 chu kỳ của 94oC trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây.
Bước kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide. Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-rad).
II.6. Giải trình tự gen 16S mtDNA thu được.
II.6.1: Cơ sở lý thuyết.
Để xác định trình tự của nucleic acid người ta sử dụng 2 phương pháp chính là phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phương pháp enzyme học
của Sanger và cộng sự (1977).
Nguyên tắc hóa học: Dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân
tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
Nguyên tắc enzyme học: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một
tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.
Ở cả 2 phương pháp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách 2 trình tự DNA chỉ chênh nhau một
nucleotide. Với việc sử dụng một loại nnucleotide có đánh dấu động vị phóng xạ,
kết quả trình tự cần xác định được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di.
Tuy nhiên, để kết quả chính xác và đáng tin cậy hơn, chúng tôi đã sử dụng phương pháp enzyme học để giải trình tự gen 16S mtDNA dựa vào bộ kit có sẵn
trên thị trường.
II.6.2. Phương pháp tiến hành:
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất. 1-2µl sản phẩm PCR đã tinh sạch được tiến hành phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau:
96°C trong 20s. 50°C trong 20s. 60°C trong 4 phút.
Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ thuật Contig
Express trong phần mềm package Vector NTI v. 9.
II.7. Phân tích đa dạng loài ốc cối.
Các trình tự của ốc cối được kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ancbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit
7.0.1, (Hall, 1999) sử dụng tính năng Clustax và được kiểm tra lại và chỉnh sửa
bằng mắt thường.
Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analyis)
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA
của ốc cối thu tại Lý Sơn, Cù Lao Chàm, Sông Cầu và vịnh Vân Phong trong năm
2008 và 2010 cụ thể như sau :
Dữ liệu gen 16S mtDNA bao gồm 39 trình tự của ốc cối trong đó 25 trình tự
từ nghiên cứu hiện tại và 14 trình tự từ Genbank. Thông tin về các trình tự, mã số
ốc thuộc họ Conoidae Lophiotoma cerithiformis và Thatcheria mirabilis từ genbank được sử dụng làm nhóm ngoại (theo Nam và cs, 2009).
Phân tích được tiến hành dựa trên 3 thuật toán maximun parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Baysain inference (BI). Các phương pháp được phân
tích bằng phần mềm PAUP4.0 (Swofford, 2001) và MyBayes 3.1.2 (Huelsenbeck
và Ronquist. 2001). Đối với thuật toán MP, 1000 độ lập lại ngẫu nhiên được áp
dụng. Tuy nhiên, đối với thuật toán ML, độ lập lại là 100 vì tổng số trình tự nghiên cứu quá lớn. Trước khi tiến hành thuật toán ML và BI, các mô hình tiến hóa đã
được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7 (Posada and Crandall, 1998) và MrModeltest 2.2 (Nylander, 2004), Mô hình tối ưu và các thông số cơ bản được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa (best-fit models) được lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion.
Thông số Dữ liệu
Tổng số trình tự
Tổng số Nucliotide dóng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony
uninformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony
informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T))
Phân bố gama (Gama distribution )
39 552 395 67 150 GTR+I+G 0.2656, 0.0897 0.1827, 0.4620 0.39546
Đối với thuật toán BI, các mô hình thay thế được tính toán. Chương trình
tích được lặp lại 2 lần để xác định độ chính xác của phương pháp phân tích. Giá trị
tin cậy (posterior probability (PP) được biểu hiện trên các nhánh của cây tiến hóa
(Huelsenbeck and Ronquist, 2001).
Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán
MP với độ lặp lại 100. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn,
chúng tôi áp dụng phương pháp successive approximation approach (Sullivan và cộng sự, 2005) đối với thuật toán ML, xác định cây tiến hóa dựa trên mô hình tiến
hóa và so sánh kết quả thu được với phương pháp phân tích MP va BI. Cây đa dạng loài được biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView 1.6.6 (Page, 1996).
Bảng 2.3: Mã số các trình tự gen 16S và chế độ ăn của các loài ốc cối trong nghiên cứu hiện tại và từ Genbank. (P: ăn cá; P+V: ăn cá và nhuyễn thể;
P+V: ăn cá và giun biển; V: ăn giun biển; M: ăn nhuyễn thể; U: chưa nghiên cứu (unknow)).
Loài Mã số gen Thức ăn
Conus achatinus FJ868053 P
Conus arenatus HM212491 V
Conus aulicus EU794324 M
Conus acutangulus AF160718 U
Conus bandanus HQ234757 M
Conus betulinus HQ234758 V
Conus bullatus FJ937342 P+M
Conus capitaneus HM212492 P+V
Conus caracteristicus HM212493 V
Conus consors EU078940 P
Conus distans HM212494 V
Conus cf. distans HQ234762 U
Conus eburneus AF174165 P+M
Conus flavidus HM898715 V
Conus generalis HQ234761 V
Conus imperialis HQ234755 V
Conus imperialisgb AF108828 V
Conus leopardus AF174175 V
Conus legatus AF174174 M
Conus literatus HM212495 V
Conus magus HM212496 P+V
Conus marmoreus HQ234759 M
Conus miles HQ234756 V
Conus mustelinus EU794332 V
Conus ebraeus EU492420 V
Conus omaria EU794332 M
Conus quercinus HM212497 V
Conus striatus HM212498 P+V
Conus sulcatus AF160714 U
Conus tesstulatus HM212499 M
Conus terebra HQ886752 M
Conus textile HM212500 M
Conus tulipa HQ978592 P+M
Conus varius HQ896748 V
Conus virgo EU794334 V
Conus vexilum HM212501 V
Lophiotoma cerithiformis EU682307
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
III.1. KẾT QUẢ.
III.1.1. Đặc điểm hình thái.
Hình thái ngoài của các loài ốc cối ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam được minh họa ở hình 3.1. 25 loài ốc cối được ghi nhận tại vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam (Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam), Sông Cầu (Phú Yên) và Vịnh Vân Phong (Khánh Hòa)). Quan sát các đặc điểm về mặt hình thái cho thấy hình dạng vỏ của các loài không khác biệt mấy so với các loài trên thế
giới nhưng vân vỏ thể hiện sự đa dạng với nhiều màu sắc và hình dạng khác nhau.
Hình 3.1. Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam.
1: Conus leopardus; 2: C. litteratus; 3, 4: C. betulinus, 5: C. quercinus; 6: C.
terebra; 7: C. magus; 8: Conus cf.distans; 9: C. distans; 10: C. textile; 11: C. bandanus; 12: C. marmoreus; 13: C. imperialis; 14, 15: C. vexilum; 16: C: capitaneus; 17: C. miles; 18: C. stratus; 19: C. generalis; 20: C. lividus; 21: C. tessulates; 22, 23: C. caracteriscus.
Quan sát hình thái ngoài của các loài ốc cối ta thấy ốc cối có kích thước, hình dạng và màu sắc rất đa dạng. Tuy nhiên, một số loài ốc có hình thái ngoài tương đối giống nhau rất dễ gây nhầm lấn. Conus bandanus (hình 11) và Conus mamoreus
(hình 12) có nhiều điểm tương đồng về màu sắc và hoa văn vỏ như vỏ có dạng búp sen, tháp vỏ thấp có 8 vòng xoắn, mặt ngoài vỏ có nhiều vân trắng hình tam giác hoặc tứ giác lớn nhỏ không đều, miệng vỏ rộng, mép trước miệng vỏ rộng hơn mép
sau miệng vỏ. Tuy nhiên sự khác biệt một số đặc điểm hình thái (đường Suture có vòng chuổi hạt nhô lên thành những ụ nhỏ với 2 dãi vân màu đen phân tách ở Conus
bandanus, trong khi đó các vân này phân bố đồng đều và không có các dãi màu đen ở Conus mamore) và di truyền cho thấy chúng là 2 loài khác nhau.
Loài Conus caracteristicus (hình 22, 23) về hình dạng bên ngoài và hoa văn
rất giống nhau, chỉ khác nhau cơ bản ở màu sắc đậm nhạt. Hoa văn đậm và rõ nét ở
hình 22. Hình 23 có màu sắc nhạt hơn. Tuy nhiên cả 2 hình tương đối giống nhau về
số lượng, hình dáng và kích thước phiến vân nhưng màu sắc các phiến vân ở hình