I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.3.3.1.Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa:
Từ các nghiên cứu độc tố của các loài ốc ăn cá cho thấy những loài có quan hệ
gần gũi thường chứa các peptide độc tố tương đồng về mặt chức năng hơn so với
các loài có quan hệ xa. Vì vậy, nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài đóng
một vai trò quan trọng trong việc phát hiện và xác định đặc tính của các conotoxin
mới. Việc phân tích quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm
hình thái giải phẫu (chủ yếu là kích thước, màu sắc và hoa văn vỏ, cấu tạo của hệ
thống tiêu hóa) thường mang lại kết quả không ổn định nhất là đối với các loài có quan hệ gần gũi và vì vậy có nhiều đặc điểm hình thái giải phẫu giống nhau.
Đối với lớp chân bụng Gastropoda, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích đa dạng loài (Grande và cs, 2008). Các marker chuẩn
của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa cytochrome b, 12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val... và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-
cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP. Việc sử dụng toàn bộ trình tự
DNA ty thể cũng nâng cao độ phân giải và độ tin cậy thống kê so với sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ.
Tuy nhiên, cho tới nay, mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để do các marker phân tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi được áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra (Espiritu và cs, 2002; Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005). Vì vậy,
trong các nghiên cứu tiến hóa gần đây, các marker DNA ty thể thường được sử
dụng kết hợp với các marker nhân có tốc độ tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Duda & Palumbi, 1999; Cunha
và cs, 2005; Duda và Kohn, 2005; Bandyopadhyay và cs, 2008; Nam và cs, 2009). Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin…và vùng không mã hóa như đoạn chèn ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2).
Duda và Kohn (2005) sử dụng chỉ thị phân tử calmodulin và 16S mtDNA của 138 loài ốc cối từ vùng biển Ấn Độ- Thái Bình Dương, Đông Thái Bình Dương và Đại Tây Dương. Kết quả chỉ ra rằng các loài hiện nay được phân hóa ít nhất cách đây 33 triệu năm và là con cháu từ 2 nhánh (lineage) chính: 1 nhóm (clade) bắt
nguồn từ biển Ấn Độ- Thái Bình Dương, còn nhóm kia ở Đông Thái Bình Dương
và Tây Đại Tây Dương.
Bên cạnh gen 16S mtDNA thì CO1 mtDNA và chỉ thị nhân ITS2 cũng được
sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa trong di truyền ốc cối.
Duda và Rolan (2005) sử dụng gen CO1 mtDNA của 90 loài ốc cối trong đó có 30 loài đặc hữu ở quần đảo Cape Verde để khảo sát mối quan hệ tiến hóa và xác
định nguồn gốc các loài ốc cối ở Cape Verde. Kết quả cho thấy các loài này được
chia thành 2 nhóm riêng biệt và thể hiện quần đàn đặc trưng cho vùng địa lý rất hẹp.
Các loài gốc xuất hiện ở một vùng rất giới hạn của quần đảo và trong một số trường
độ phân hóa giữa các loài đặc hữu ở quần đảo Cape Verde và các loài ốc cối khác
cho thấy sự phân hóa ở Cape Verde chỉ xảy ra khoảng vài triệu năm gần đây.
Cunha và cs (2008) tiếp tục nghiên cứu phát sinh chủng loại của 4 loài ốc thuộc nhánh có vỏ lớn là C. ateralbus, C. pseudonivifer, C. trochulus, và C. venulatus sử dụng các gen coxI (mã hóa cytochrome oxidase I) và nad4 (mã hóa
tiểu đơn vị 4 của NADH dehydrogenase) (tiến hành trên 200 mẫu ốc thu thập tại 16
địa điểm thuộc các đảo Sal, Boavista và Maio). Kết quả cho thấy, các mẫu ốc thuộc 4 loài này được chia làm 3 nhánh rõ ràng, tương đối cách xa nhau mà việc phân loại dựa vào màu sắc vỏ và hoa văn không thể thấy được (Cunha và cs, 2008).
Nam và cs (2009) sử dụng chỉ thị nhân ITS2 (đoạn chèn giữa gen mã hóa
5,8S và 28rRNA) để đánh giá mối quan hệ tiến hóa của 26 loài ốc thu thập tai vùng biển thuộc quần đảo Marinduque, Philippines. Kết quả cho thấy trình tự ITS2 được
bảo tồn giữa các cá thể thuộc cùng một nhóm dinh dưỡng, nhưng lại thể hiện sự đa
dạng ở mức độ phù hợp cho việc xác định vị trí phân loại của các loài mới phân hóa. Hơn nữa, việc sử dụng các chỉ thị ti thể (12S rDNA, 16S rDNA, COI) và chỉ
thị ITS2 rDNA đã chia nhóm ăn nhuyễn thể (M) thành 3 nhánh rõ ràng là Conus, Cyclinder và Darioconus.
Như vậy, việc sử dụng rộng rãi các chỉ thị phân tử, đặc biệt là việc kết hợp
các chỉ thị phân tử DNA ti thể và DNA bộ gen đã góp phần làm sáng tỏ mối quan
hệ loài ốc cối nói chung là theo vùng địa lý nói riêng. Các nghiên cứu cũng giúp
nâng cao hiểu biết về lịch sử tiến hóa, địa sinh học của ốc cối cũng như phân biệt
các loài cận giống.
I.3.3.2. Mối liên hệ giữa phát sinh loài ốc cối (Conus spp.) và chế độ dinh dưỡng
Ốc cối được biết đến như một giống có hình thức dinh dưỡng chuyên biệt hóa. Độc tố của chúng cũng tiến hóa tùy thuộc vào phương thức săn mồi là cá (piscivorus species), nhuyễn thể (molluscivorus species) hay giun biển (vermivorus
species) (Lewis, 2009).
Duda và Palumbi (2004) sử dụng chỉ thị 16S và calmodulin đã xây dựng phát
13 loài ăn giun biển có nguồn gốc từ các vùng biển Hawaii, USA, Cape Verde, Las
Islas Perlas, Panama, American Samoa. Kết quả cho thấy rằng loài ăn cá có cùng
một nguồn gốc với các loài khác tuy nhiên chúng tiến hóa hơn về thành phần, cấu
trúc của tuyến độc tố do loại thức ăn (Duda và Palumbi, 2004).
Duda và cs (2001) sử dụng chỉ thị 16S và calmodulin đã xây dựng phát sinh chủng loại của 76 loài ốc cối Conus, trong đó 75 loài có nguồn gốc từ các vùng biển
Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và 1 loài có nguồn gốc từ Đông Đại Tây Dương.
Kết quả cho thấy rằng hình thức dinh dưỡng cổ xưa nhất là ăn giun biển di chuyển (errant polychaetes) do chúng chiếm phân nửa các nhóm (clade) trên cây tiến hóa. Các dạng dinh dưỡng khác như ăn các loài chân bụng, và một số họ giun biển khác
như Terebellindae, Nereidae và Amphinomidae được tách ra một lần, trong khi đó các loài ăn cá được tách ra từ 2 đến 3 lần trên cây tiến hóa. Hình thức dinh dưỡng phân hóa nhất được tách ra từ kỷ Miocene. Phần lớn các đa đạng của ốc cối phát sinh từ kỷ Miocene và tồn tại đến ngày nay (Duda và cs, 2001).
I.3.3.3. Nghiên cứu cấu trúc hệ gen.
Bandyopadhyay và cs (2008) xác định cấu trúc hệ gen ti thể của Conus
textile cho thấy thứ tự các gen tương đồng với hệ gen của Lophiotoma cerithiformis
(Gastropoda: Conoidea) (Bandyopadhyay và cs, 2006) và Ilyanassa obsolete
(Gastropoda, Neogastropada). Tuy nhiên, đoạn chèn giữa gen coxI và coxII lớn nhất ở C. textile (165bp) hơn tất cả các loài chân bụng đã phân tích trước đây (hình 1.13).
Hệ gen ty thể Conus textile là một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài 15.562 nucleotide mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA. Trong đó, các gen
mã hóa protein ty thể bao gồm: các gen coxI-III mã hóa cho cytochrome oxidase 1- 3; các gen atp6 và atp8 mã hóa cho các tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPase; các gen
nad1-6 và nad 4L mã hóa cho các tiểu đơn vị 1-6 và 4L của NADH dehydrogenase; gen cob mã hóa cho cytochrome b. Các gen khác bao gồm 2 gen mã hóa rRNA (gen
rrnS mã hóa 12S rRNA và gen rrnL mã hóa cho 16S rRNA) và 22 gen mã hóa các
khi các tRNA cho M, Y, C, W, H, G, E, và T được sao chép từ các sợi bổ sung.
Đoạn chèn giữa gen dao động từ 0 đến 35 nucleotide (nt) với 2 vùng lớn của gen
165 và 126 nucleotide giữa CoxI và CoxII và giữa tRNAphe và giữa coxIII. Trình tự
mã hóa của gen NAD4 và NAD4L trùng lặp bởi 7 nt; NAD4 và tRNAHis bởi 1 nt;
NAD5 và tRNAPhe cũng bởi 1 nt; tRNATip và tRNAGin bởi 3 nt (Bandyopadhyay và cs, 2008).
Hình 1.13: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile.
Mũi tên ký hiệu gen CO1 và 16S.
I.3.3.4. Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam.
Pham và cs (2010) đã sử dụng chỉ thị 16S rDNA để khảo sát mối quan hệ
tiến hóa của 18 loài ốc cối ở vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam (Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam), Bình Thuận, Vân Phong (Khánh Hòa)). Kết quả cho thấy các loài ốc cối thuộc các kiểu dinh dưỡng khác nhau (ăn giun biển, ăn cá, ăn nhuyễn thể) phân chia thành 4 nhánh chính. Trong đó các loài ốc cối thuộc
nhóm ăn giun biển được phân tách rõ ràng hơn trên câu tiến hóa với 2 nhóm dinh
dưỡng còn lại. Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị 16S rDNA vẫn có những hạn chế
I.3.3.5. Nghiên cứu di truyền độc tố.
Theo Becker và Terlau (2008), Olivera và cs (1987), Hillyardetal (1992) nghiên cứu ω-conotoxin MVIIA từ Conus magus cho thấy độc tố ω-conotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với tiểu đơn vị α2-δ của kênh canxi, làm thay đổi cấu hình của tiểu đơn vị này, dẫn tới kìm hãm sự vận chuyển ion canxi qua màng tế
bào, sự truyền tín hiệu của các nơron thần kinh bị khóa. Khả năng ngăn chặn này rất chính xác, làm cho tín hiệu đau đớn không tới não được mà thần kinh vẫn làm việc bình thường. Do vậy, các độc tốốc cối được sử dụng trong điều trị các cơn đau mạn tính, các bệnh thần kinh như Parkinson, bệnh thuộc hệ thần kinh tự động, ung thư, tim mạch và nhiều bệnh khác mà không gây nghiện như morphine.
Liu và cs (2009) nghiên cứu xác định các peptide của I-superfamily từ các loài Conus ở vùng biển phía Nam Trung Quốc. Các peptide này đại diện cho một lớp peptide mới với 4 cầu nối disulfide (-C-C-CC-CC-C-C-) rơi vào 3 loại I1, I2, I3 theo các trình tự khác nhau của peptide tín hiệu. Kết quả cho thấy 11 conotoxin của I-superfamily được ghi nhận từ ống dẫn độc của 5 loài ốc cối (Conus eburneus,
Conus imperialis, Conus vitulinus, Conus emaciatus và Conus litteratus), sự sắp
xếp của các trình tự cho thấy vùng tín hiệu có mức độ bảo tồn vừa phải tương ứng
21.1%, 38,5% và 30.0% cho các peptide tín hiệu của I1, I2, I3 superfamily. Phân
tích cây tiến hóa của các peptide này thấy 9 trong số 11 conotoxins rơi vào nhánh I2 superfamily, nhưng 2 conotoxins còn lại không rơi vào nhánh I1,I2 hay I3 (Liu và cs, 2009).
Loughnan và cs (2006) mô tả các đặc điểm hóa học và chức năng của ba
conotoxin αD-VxXIIA, αD-VxXIIB, and αD-VxXIIC được tinh chế từ tuyến nọc độc của Conus vexillum, các conotoxin này đều có hiệu lực tác động lên thụ thể
nicotinic acetylcholine (nAChRs).
Espiritu và cs (2001) sử dụng trình tự 16S mtDNA từ 9 loài ốc cối để xác
định δ- conotoxin (phân tích dựa trên đoạn >80) xuất phát từ 3 nhóm loài riêng biệt. Về mặt tiến hóa, 4 cơ chế khác nhau được cho là tác động đến sự đa dạng của δ- conotoxin (1) Sự hình thành loài mới : δ- conotoxin phân hóa từ các loài khác nhau
(tỷ lệ biến hóa của vùng khởi động của các gen đồng dạng chậm hơn vùng rRNA,
vùng mã hóa độc tố tiến hóa với tốc độ nhanh hơn) ; (2) Sự nhân đôi gen : biến dị
cùng loài của đa dạng δ- conotoxin được bắt đầu bởi quá trình nhân đôi gen, một vài trong số chúng có thể; (3) Sự tái tổ hợp: δ- conotoxin mới có thể xuất hiện từ sự tái tổ hợp của δ- conotoxin bố mẹ; (4) Đột biến (Forcal hypermutation : Sự thay đổi đột ngột một số trình tự thường biểu hiện trong δ- conotoxin đã được mã hóa. Ba cơ chế đầu được biết là nhân tố quan trọng trong quá trình tiến hóa của sinh vật, riêng cơ
chế cuối cùng được cho là đặc tính quan trọng, khó giải thích và chuyên biệt cho sự đa dạng của peptide ốc cối.
I.3.3.6. Nghiên cứu di truyền quần thểốc cối và động vật thân mềm.
Mức độ khác biệt di truyền giữa các quần thể địa phương của các sinh vật biển không xương sống cung cấp bằng chứng quan trọng và gián tiếp, phản ánh mô hình và quy mô phát tán địa phương. Hầu hết các loài hải sản có khả năng phát tán ấu trùng cao cho thấy sự hạn chế trong khác biệt di truyền quần thể bởi sự di chuyển
gen thường tương quan tích cực với khả năng phát tán (Hansen, 1980). Trong các
loài nhuyễn thể biển, ví dụ, loài có ấu trùng phù du có mức độ di chuyển gen cao và
thường ít biểu hiện cấu trúc di truyền quần thể hơn các loài có ấu trùng không trôi nổi và khả năng phát tán thấp (Kim và cs, 2003).
Vùng biển Hàn Quốc đang chịu ảnh hưởng bởi những hệ thống dòng chảy
khác nhau, điều này có thể dẫn đến sự khác biệt di truyền nhất định giữa các quần thể các loài động vật không xương sống ở vùng biển Hàn Quốc. Để thử nghiệm giả
thuyết này, Kim và cs (2003) kiểm tra sự khác biệt di truyền của 14 quần thể loài chân bụng Littorina brevicula phân bố rộng rãi ở vùng biển Hàn Quốc, sử dụng chỉ
thị phân tử cyt b và ND6 của DNA ty thể. Chuỗi trình tự 500bp của cyt b mtDNA cho thấy sự tồn tại haplotype lần lượt là 14 và 24. Phân tích mối quan hệ giữa khu vực phân bố và sự đa dạng di truyền (NCA) cho thấy không có liên quan đáng kể
giữa vùng địa lý và phân bố haplotype. Nhóm tác giả ghi nhận sự tồn tại ở mức độ
cao của sự di chuyển gen loài L. brevicula quanh các vùng biển Hàn Quốc. Việc thiếu các cấu trúc di truyền và di chuyển gen ở mức độ cao trong các quần thể này,
có thể do sự phân tán của ấu trùng phù du của loài này, ngay cả dưới ảnh hưởng của các hệ thống dòng chảy hiện nay, có thể do sự phân tán của ấu trùng phù du loài này trong dòng chảy chính ở phía tây bắc Thái Bình Dương.
Duda và Lesion (2009) đã tiến hành nghiên cứu quần thể loài Conus ebraeus, một loài ốc có vùng phân bố rất rộng ở khu vực Thái Bình Dương dựa trên gen CO1 mt DNA. 92 cá thể ốc cối được thu từ 8 vùng phân bố. Tổng số 43 haplotype đã
được phát hiện, bao gồm haplotype phổ biến xảy ra ở 6 trong 8 quần thể nghiên cứu. Phân tích AMOVA và pairwise F cho thấy quần thể tây và trung tâm Thái Bình
Dương khác biệt có ý nghĩa thống kê với quần thể đông Thái Bình Dương, nhưng
không thể hiện rõ cấu trúc quần thể. Phân tích Bayesian isolation-migration (IM) cho thấy tây và trung tâm Thái Bình Dương phân tách từ quần thể phía đông từ kỷ
Pleistocence. Sự di chuyển gen (gen flow) dọc theo vùng ngăn cách đông Thái Bình
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1. Đối tượng và địa điểm thu mẫu:
Các loài ốc cối thu được tại vùng biển thuộc Đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam), vịnh Vân Phong (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên).
Ốc cối sau khi thu được giữ trong nitơ lỏng và trong cồn tuyệt đối (để thử nghiệm phương pháp bảo quản), vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm, phân loại và lưu
giữ ở -700C cho các phân tích tiếp theo. Thời gian thu mẫu từ năm 2008-2010. Địa điểm thu mẫu được mô tả ở hình 2.1.
Các loài ốc cối thu được tại vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam: Conus
textile, Conus striatus, Conus vexillum, Conus capitaneus, Conus miles, Conus litteratus, Conus caracteristicus, Conus distans, Conus quercinus, Conus magus, Conus arenatus, Conus tessulatus, Conus marmoreus,Conus lividus, Conus generalis, Conus bandanus, Conus betulinus, Conus imperalis, Conus varius, Conus lynceus, Conus mustelius, Conus leopadus, Conus achatinus, Conus terebra
và Conus cf.distans.
Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu ốc cối Conus spp. (chữ đỏ).