2.2.1 Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc của thử nghiệm này nhằm xác định hiện diện của enzyme catalase của vi sinh vật.
Cơ sở sinh hĩa như sau: enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí cĩ hệ thống cytochrom. Những vi sinh vật kỵ khí như Clostridium cĩ hệ thống peroxydase thay cho enzyme catalase. Tuy thế enzyme catalase hoạt động khơng chuyên biệt và chúng cĩ thể can thiệp vào hoạt động của enzyme peroxidase.
Phương pháp tiến hành thử nghiệm: Hĩa chất sử dụng là H2O2 30%. Dùng que cấy vịng lấy một ít sinh khối đặt lên lame, nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật, hoặc cĩ thể thử trong ống thạch nghiêng và đĩa petri mơi trường đặc, tương tự nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối của vi sinh vật.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi cĩ hiện tượng sủi bọt khí, thử nghiệm (-) là khơng cĩ hiện tượng sủi bọt.
2.2.2 Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của vi khuẩn cĩ thể tạo Indol trong mơi trường trypton. Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic, từ đĩ indol được hình thành thơng qua quá trình khử amin, hình thành skatol (metyl indol) là quá trình khử carboxyl cùa acid indol acetic. Enzyme tryptophan xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng giữa phân từ này với thuốc thử chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB). Nhân pyrrol của indol chứa nhĩm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone cĩ màu đỏ.
Cơ sở sinh hĩa của thử nghiệm như sau: Tryptophan là một aminoacid cĩ thể bị oxy hĩa bởi một số vi sinh vật cĩ hệ enzyme tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa gốc indol.
Phương pháp tiến hành: Vi sinh vật thử nghiệm được nuơi trong mơi trường canh trypton trong khoảng 24 - 48 giờ, sau đĩ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc thử Erhlich, quan sát màu vài phút.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi trên bề mặt mơi trường xuất hiện vịng đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-) khi trên bề mặt mơi trường khơng xuất hiện vịng đỏ.
2.2.3 Thử nghiệm Metyl Red
Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bên trong mơi trường trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hĩa :thử nghiệm Metyl red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là metyl red để nhận biết lượng ion H+ cĩ trong mơi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Hàm lượng hai chất này lại tùy thuộc vào con đường chuyển hĩa của từng loại vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuơi cấy từ 18 – 24 giờ, các vi sinh vật này đều tạo acid trong mơi trường khi chúng bắt đầu phát triển. Đối với các vi sinh vật cho phản ứng Metyl red âm tính thì ngay ban đầu một lượng acid hình thành trong mơi trường nhưng kéo dài thời gian nuơi cấy chuyển hĩa các sản phẩm acid này thành acetoin do đĩ làm pH mơi trường trung tính.
Phương pháp tiến hành: Nuơi cấy vi sinh vật trong mơi trường MRPV, ủ trong khoảng 2 – 5 ngày, sau đĩ nhỏ vài giọt thuốc thử metyl red được pha theo tỷ lệ 0.1g trong 300ml cồn và cho vào nước định mức 500ml.
Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi mơi trường chuyển sang màu đỏ. Thử nghiệm (-) khi mơi trường khơng đổi màu.
2.2.4 Thử nghiệm Voges-Proskauer
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetoin trong q trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hĩa: Thử nghiệm này nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong q trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đĩ cĩ thể chia vi sinh vật thành 2 nhĩm theo con đường chuyển hĩa pyruvic khác nhau : nhĩm trao đổi khơng tạo thành 2,3-butanediol như E.coli thử nghiệm (-) ; và nhĩm tạo 2,3-butanediol như Klebsiella thử nghiệm (+). Tuy nhiên thử nghiệm này nhằm xác định acetoin – tiền chất của 2,3-butanediol, vì là tiền chất nên q trình nuơi cấy tích lũy rất ít, để dễ dàng phát hiện q trình nuơi cấy thử nghiệm được tiến hành trong điều kiện hiếu khí, sau đĩ phát hiện acetoin trong mơi trường bằng thuốc thử α-naphtol trong mơi trường kiềm mạnh được tạo ra bằng KOH 40%.
Phương pháp tiến hành: Nuơi cấy vi sinh vật trong mơi trường MRPV ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 – 5 ngày, sau đĩ nhỏ 2 giọt KOH 40% và 6 giọt α-naphtol rồi quan sát sự xuất hiện màu.
Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi xuất hiện màu đỏ trên bề mặt mơi trường. Thử nghiệm (-) khi mơi trường khơng đổi màu.
2.2.5 Thử nghiệm Citrate
Cơ sở sinh hĩa: Năng lượng cung cấp cho vi sinh vật khi trong mơi trường khơng cĩ nguồn nguyên liệu để sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng nguồn carbon duy nhất là citrate.
Bước đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate, đây là hai sản phẩm trung gian cho quá trình đồng hĩa citrate, cịn sản phẩm nhận được của quá trình này phụ thuộc vào pH của mơi trường. Nếu pH kiềm thì trong mơi trường sẽ nhận được nhiều acetate và fomate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactatte, acetoin.
Như vậy sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hĩa mơi trường. Mặt khác các vi sinh vật cĩ khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất thì cĩ khả năng sử dụng muối amonium như là nguồn đạm duy nhất sinh ra NH3 làm kiềm hĩa mơi trường.
Trong mơi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất cĩ chứa đạm ở dạng muối amonium sẽ làm tăng pH của mơi trường thể hiện qua sự đổi màu của chỉ thị pH trong mơi trường.
Phương pháp tiến hành: Mơi trường sử dụng trong thử nghiệm là Simmon citrate agar hay mơi trường lỏng Koser. Cấy vi sinh vật lên mơi trường thạch nghiêng Simmon citrate agar và ủ ở 370C trong 24 giờ lấy ra quán sát.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi mơi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương. Thử nghiệm (-) là mơi trường khơng đổi màu.
2.2.6 Thử nghiệm trên mơi trường KIA/TSI
Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn carbonhydrat cĩ mặt trong mơi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas.
Cơ sở sinh hĩa: Mơi trường KIA là mơi trường rắn chứa lactose 1%, glucose 1%, TSI tương tự nhưng chứa thêm sucrose 1%. Cĩ 3 trường hợp xảy ra khi nuơi cấy vi sinh vật trên mơi trường KIA :
- Chỉ lên men glucose, lên men cả hai loại đường và khơng lên men cả hai nguồn
trên. Nếu vi sinh vật chỉ sử dụng glucose sau 24 giờ nuơi cấy làm phần nghiêng cĩ pH kiềm vì sau khi sử dụng hết lượng glucose thì vi sinh vật sử dụng pepton trong mơi trường làm giải phĩng NH3 nên mơi trường phần nghiêng cĩ pH kiềm, ở phần sâu mơi trường cĩ sự lên men kỵ khí glucose các sản phẩm thu được là acid hữu cơ làm mơi trường pH acid do trong mơi trường cĩ chứa chất chỉ thị pH (thường là phenol red) thì phần nghiêng của mơi trường sẽ cĩ màu đỏ và phần sâu cĩ màu vàng.
- Nếu vi sinh vật sử dụng cà hai nguồn đường nên phần nghiêng và sâu đều cĩ tính acid nên cả mơi trường màu vàng.
- Trong trường hợp cả hai nguồn carbon khơng được sử dụng thì nguồn pepton được sử dụng và làm mơi trường pH kiềm nên cả mơi trường cĩ màu đỏ.
Trong mơi trường nếu cĩ tạo thành H2S thì mơi trường cĩ màu đen , cĩ sinh gas thì gas sẽ tích tụ làm vỡ thạch hoặc tạo thành các bọt khí bên trong.
Đối với mơi trường TSI thì các phản ứng xảy ra tương tự, tuy nhiên trong trường hợp cả phần nghiêng và phần sâu cĩ hiện tượng acid là do một trong hai hoặc cả hai nguồn sucrose và lactose được sử dụng. Trong trường hợp này cần làm thêm các thử nghiệm trên mơi trường lactose và sucrose.
Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật trên mơi trường thạch nghiêng TSI hoặc KIA ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ, sau đĩ quan sát sự đổi màu mơi trường
Đọc kết quả: Mơi trường phần nghiêng màu đỏ, phần sâu màu vàng sử dụng glucose; phần nghiêng và phần sâu màu vàng khơng sử dụng các nguồn đường trên; phần nghiêng và sâu màu vàng sử dụng các nguồn đường trên.
2.2.7 Thử nghiệm tính di động trên mơi trường thạch mềm
Phương pháp tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật trong mơi trường cĩ bổ sung 0.5 – 0.6% agar, ủ ở 370C sau 24 – 48 giờ sau đĩ quan sát.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi vi sinh vật mọc lan ra đường cấy và làm đục mơi trường xung quang. Thử nghiệm (-) khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đường cấy và mơi trường vẫn trong.
2.2.8 Thử nghiệm Urease
Nguyên tắc: Nhằm xác định vi sinh vật cĩ khả năng phân hủy urea thành amonia và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi sinh vật tiết ra.
Cơ sở sinh hĩa: urea là một hợp chất carbamide rất dễ thủy giải, sự thủy giải của urea dưới sự xúc tác của urease sẽ giải phĩng hai phân tử ammonia. Khi cĩ cơ chất urea hiện diện trong mơi trường, urease được tổng hợp và phĩng thích ra mơi trường bên ngồi tế bào xúc tác phản ứng thủy giải urea. Các sản phẩm sau phản ứng làm mơi trường hĩa kiềm và làm chuyển màu chất chỉ thị pH
Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật vào mơi trường urea cĩ chứa chất chỉ thị là phenol red ủ ở 370C trong 12 – 18 giờ, sau đĩ quan sát sự đổi màu.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi mơi trường chuyển sang màu dỏ hồng. Thử nghiệm (-) khi mơi trường khơng đổi màu.