2.6 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hĩa sinh
2.6.2 Phương pháp xác định đạm tổng số
- Nguyên tắc:
Hàm lượng protein thơ được tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lượng nitơ tổng. Trước tiên vơ cơ hĩa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vơ cơ hĩa xảy ra như sau:
2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2
Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hĩa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; cịn nitơ được giải phĩng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4.
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO,... Giai đoạn chưng cất giải phĩng NH3 : tạo mơi trường kiềm đuổi nitơ ra khỏi dung dịch dưới dạng NH3.
( NH4 )2SO4 Na2SO4 + NH3 + H2O
NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0.1N.
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N
H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O
- Hĩa chất H2SO4 đậm đặc NaOH 40% H2SO4 0.1N chuẩn NaOH 0.1N chuẩn Thuốc thử Tasiro Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) - Tiến hành Vơ cơ hĩa mẫu
Hút 1ml nước mắm cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hĩa). Cho thêm chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh
Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì cĩ thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình cịn chưa bị oxi hố vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hồn tồn. Để nguội bình rồi chuyển tồn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vơ đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.
Cất đạm
Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm cĩ sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình cĩ màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi tồn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch cĩ màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật cơng tắc cất đạm
Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH cịn được tạo ra khơng, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy khơng đổi sang màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
- Chuẩn độ:
Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.
- Tính kết quả
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo cơng thức
N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2
V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu
1,42 hệ số ; cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hịa NH4OH thì tương đương với 1,42mg Nitơ