vi khuẩn Bacillus subtilis.
2.3.1 Phân lập giống
Giống Bacillus subtilis được phân lập từ nguồn natto của Nhật Bản và cỏ khơ. Mẫu
được cắt nhỏ cho vào bình tam giác, cho nước máy vào bình, đem đi đun sơi khoảng 15 phút. Sau đĩ đem đi ủ ở 370C trong vịng 48 giờ.
Sau 48 giờ, ta sẽ thấy một lớp váng xám, nhăn xuất hiện trên bề mặt. Ta sẽ đem đi pha lỗng đến độ pha lỗng thích hợp, rồi cấy trang ra đĩa petri, đem ủ ở 370C trong 24 giờ để tạo ra các khuẩn lạc Bacillus subtilis riêng rẽ. Sau khi tạo được các khuẩn lạc riêng rẽ
phải kiểm tra lại độ thuần của giống bằng cách pha giống với nước muối sinh lý dùng kỹ thuật cấy ria sau đĩ quan sát sự thuần khiết của khuẩn lạc cũng chính là sự thuần khiết của giống. Kiểm tra và chọn khuẩn lạc tốt đem đi cấy truyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống.
2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme protease
- Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease tren cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme protease.
- Hĩa chất
Dung dịch đệm phosphate - pH 7- 0,1M Dung dịch tyrosin chuẩn 1µmol/ml Dung dịch casein 1%
Dung dịch TCA (trichloracetic acid) 5% Na2CO3 0,4M
Thuốc thử folin (pha lỗng 5 lần) Dung dịch NaOH 0,5N
Dung dịch HCl 0,1M
- Cách tiến hành
Dựng đường chuẩn tyrosin
Số ống
nghiệm
Mẫ u đối chứ ng: Lấy dung dịch HCl 0,1M thay cho dung dịch tyrosin và tiến hành như trên.
Xác định hoạt tính enzyme protease
Chúng ta sẽ hút 1ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm và đem ủ ở 370C trong 10-15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme đã được pha lỗng (10 lần) vào và lắc đều, rồi đem đi ủ ở 370C trong 60 phút. Sau đĩ cho vào hỗn hợp này 2ml dung dịch TCA, để ổn định dung dịch trong 25 phút, đem dung dịch đi lọc để loại tủa. Hút 1ml dịch lọc vào ống nghiệm khác và cho tiếp 5ml dung dịch Na2CO3 vào, thêm 1ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh thì đem đi đo quang ở bước sĩng 660nm.
Mẫu đối chứng: Lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành như trên.
- Kết quả
Hoạt tính của enzyme protease được tính dựa vào định nghĩa: Một đơn vị hoạt
tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100µg Tyrosin trong 1ml dung dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính enzyme protease (DVHT/g) = (A – A0) * F * n * 1/100 A: Độ hấp thụ của mẫu Tyrosin ( ml ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HCl 0,1M ( ml ) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Na2CO3 0,4M ( ml ) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1
Lắc đều, để ổn định dung dịch trong 20 phút ở 370C Đo hấp thụ của dung dịch ở bước sĩng 660nm
A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng F: Lượng Tyrosin từ đường chuẩn n: Hệ số pha lỗng của enzyme
2.3.3 Xác định hoạt tính enzyme amylase
- Nguyên tắc
Hoạt tính enzyme amylase xác định theo phương pháp Smith và Roe (1996).
Hoạt tính amylase biểu thị cho khả năng của amylase xúc tác thủy phân bột đến dextrin trong 1 phút ở 500C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đĩ trong 1g mẫu. Khi phản ứng phân hủy tinh bột xảy ra, lượng tinh bột cịn lại chưa được phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được đem đi đo quang.
- Hĩa chất Dung dịch đệm phosphate 1/15M, pH 6.2 Dung dịch tinh bột 1% Dung dịch Lugol Dung dịch HCl 1N Dung dịch NaCl 3% - Cách tiến hành ống chuẩn ống thử
1 ml nước cất 1 ml dung dịch enzyme các mẫu
1 ml dung dịch đệm 1 ml dung dịch đệm
1 ml tinh bột 1 ml tinh bột
Tất cả đem ủ ở 500C trong 30 phút và sau đĩ cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml HCl để kìm hãm ngay sự hoạt động của enzyme. Sau đĩ nước cất vào mỗi ống nghiệm đến 10 ml. Cho tiếp vào mỗi ống 1 giọt Lugol. Đo OD ở bước song 595 nm.
- Kết quả
UI = [(E0 – E1) * C * L] / (E0 * T) E0: Mật độ quang học của ống chuẩn
E1: Mật độ quang học của ống thử
C: Lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (10mg) L: Hệ số pha lỗng
T: Thời gian phản ứng (30 phút)