CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.3Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát các thơng số trong giai đoạn dịch hố
Khảo sát 3 thông số: % enzyme pectinse bổ sung, nhiệt độ, thời
gian.
Xác định khả năng chống oxy hoá
của sản phẩm sau thanh trùng
Sản phẩm: nước tỏi đen
Xác định hàm lượng polyphenol tổng Khả năng chống oxy hoá theo phương pháp
DPPH
Hàm lượng chất khơ hồ tan
Kiểm nghiệm vi sinh
Hàm lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí Hàm lượng E.coli Nguyên liệu Tỏi đen (Lý Sơn, Sóc Trăng, Phan Rang) Xác định hàm lượng polyphenol tổng Khả năng chống oxy hoá theo phương pháp
DPPH Xác định hàm lượng polyphenol tổng Khả năng chống oxy hoá theo phương pháp
DPPH
Hàm lượng chất khơ hồ tan Hàm lượng chất khơ hồ tan
2.3.4 Thí nghiệm 1: Lựa chọn nguyên liệu làm nƣớc tỏi đen thích hợp trong ba loại tỏi từ các vùng: Lý Sơn, Sóc Trăng, Phan Rang để sử dụng trong quy trình sản xuất
Hình 2.9. Quy trình lựa chọn nguyên liệu làm nước tỏi đen
Mục đích: Lựa chọn được nguyên liệu (tỏi đen được lên men từ tỏi trồng ở ba
vùng) có khả năng chống oxy hố cao nhất để đưa vào trong quy trình sản xuất nước tỏi đen. Tỏi tươi Tỏi đen Nghiền Dịch hố Đun sơi Làm nguội Lọc 90oC, 5 phút Khảo sát các chỉ tiêu
- Chọn % enzyme pectinase bổ sung theo khối lượng mẫu là 3%, nhiệt độ 45oC, thời gian 5 giờ. Một số nghiên cứu dịch hoá đối với tỏi đen cũng chọn các khoảng khảo sát tương tự [33], [45].
- Để có thể đảm bảo độ đồng nhất và ổn định của nguyên liệu, một lượng lớn nguyên liệu được thu gom một lần. Sau đó tiến hành bóc vỏ, lên men thành tỏi đen rồi sau đó bảo quản ở nhiệt độ -50C.
- Theo Cowan (1999) dung mơi thích hợp để chiết các hợp chất phenolic là nước, ethanol và methanol [47]. Nhưng vì sản phẩm là thức uống dinh dưỡng nên trong nghiên cứu ta chọn dung môi là nước để tiến hành khảo sát. Tỉ lệ giữa cơ chất và nước lựa chọn là 1:10 (g/ml) [48], [49].
Đối tƣợng khảo sát
- Nguồn nguyên liệu đầu vào đóng vai trị quyết định đối với chất lượng của chuỗi sản xuất. Mỗi loại tỏi khác nhau, được trồng ở các điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu khác nhau sẽ có các tính chất vật lý, hố học khác nhau cũng như sự khác biệt về hàm lượng các hoạt chất sinh học bên trong [12]. Cho nên việc lựa chọn đối tượng khảo sát là rất cần thiết. - Ở phạm vi của nghiên cứu này lựa chọn tỏi nhiều nhánh của ba vùng Lý Sơn, Phan Rang, Sóc Trăng. Đây là ba vùng trồng tỏi lớn, có sản lượng ổn định.
- Việc lựa chọn tỏi nhiều nhánh nhằm mục đích làm giảm chi phí thu mua nguyên liệu. Đồng thời việc bóc vỏ tỏi trước khi lên men sẽ giúp rút ngắn thời gian lên men so với tỏi cơ đơn từ đó hạ giá thành sản phẩm.
Cách tiến hành
- Tỏi đen sau quá trình lên men được bảo quản ở điều kiện -4oC. Khi tiến hành thí nghiệm sẽ được nghiền bằng máy xay nhằm mục đích phá vỡ tế bào, tăng diện tích tiếp xúc của enzyme và cơ chất. Sau đó, tiến hành cân định lượng 2g tỏi đen hoà cùng 200ml nước cho vào becker 250ml, bổ sung 3% enzyme pectinase so với khối lượng mẫu. Mẫu được ủ trong tủ ấm ở 45 oC, thời gian dịch hoá là 5 giờ.
- Sau 5h, tiến hành vô hoạt enzyme bằng cách đun cách thuỷ 90oC, 5 phút. Sau khi vô hoạt, tiến hành lọc dịch tỏi đen bằng thiết bị lọc chân không. Phần dịch lọc thu được sẽ được bảo quản lạnh ở nhiệt độ -4oC.
- Sau đó, tiến hành các thí nghiệm xác định khả năng chống oxy hoá của dịch tỏi đen của ba loại tỏi: Lý Sơn, Phan Rang, Sóc Trăng.
- Hàm lượng polyphenol tổng của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hoá. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khả năng chống oxy hoá của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hoá. - Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.
- Điều kiện dịch hố nào cho dịch trích khả năng chống oxy hoá cao nhất sẽ được chọn để tiếp tục nghiên cứu
Hàm mục tiêu
+ Khả năng chống oxy hoá:
Hàm lượng polyphenol tổng
Hoạt tính chống oxy hố dựa vào khả năng bắt gốc tự do DPPH
2.3.5 Thí nghiệm 2: Xác định các thơng số dịch hố.
Mục đích: tìm được điều kiện dịch hố thích hợp để thu được dịch trích có hoạt
tính kháng oxy hố cao nhất.
- Theo nghiên cứu đã công bố, % enzyme pectinase sử dụng trong giai đoạn dịch hoá tỏi đen là 3% (theo khối lượng mẫu) nên chúng em chọn tỉ lệ enzyme pectinase bổ sung với % thấp nhất là ở điều kiện thường (0%), với bước nhảy là 1%, % enzyme pectinase bổ sung nhiều nhất là 5% (theo khối lượng mẫu) [33].
- Chọn nhiệt độ thấp nhất cho khảo sát là ở điều kiện 40oC, với bước nhảy 5oC, nhiệt độ cao nhất là 60oC. Một số nghiên cứu cũng chọn khoảng nhiệt độ tương tự [45]. Ngoài
ra, nếu nhiệt độ q trình dịch hố q cao có thể làm tăng tốc độ phản ứng oxy hoá của các hợp chất phenolic dẫn đến hàm lượng bị giảm đi [51].
- Lựa chọn thời gian dịch hoá trong khoảng 4-8 giờ. Với bước nhảy là 1 giờ.
Tiến hành
- Kế hoạch thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 2.3. Bảng kế hoạch thí nghiệm xác định các thơng số trong giai đoạn dịch hố tỏi đen
Thí nghiệm Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định
2.1 Xác định % enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu).
% enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu): 1%, 2%, 3%, 4%, 5%.
- Thời gian dịch hoá: 5 giờ. - Nhiệt độ dịch hố: 45oC. - Giống tỏi: Lựa chọn từ thí nghiệm 1. 2.2 Xác định nhiệt độ thích hợp của q trình dịch hố Nhiệt độ dịch hố: 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC
-Thời gian dịch hoá: 5 giờ. - Giống tỏi: Lựa chọn từ thí nghiệm 1.
- % enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu): Lựa chọn từ thí nghiệm 2.1. -
2.3 Xác định thời gian thích hợp của q trình dịch hố
Thời gian thích hợp: 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ, 8 giờ.
- Giống tỏi: Lựa chọn từ thí nghiệm 1.
- % enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu): lựa chọn từ thí nghiệm 2.1.
- Nhiệt độ dịch hố: lựa chọn từ thí nghiệm 2.2.
- Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần
- Hàm lượng polyphenol tổng của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hố.
- Khả năng chống oxy hố của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hố. - Điều kiện dịch hố nào cho dịch trích khả năng chống oxy hố cao nhất sẽ được chọn để tiếp tục nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm mục tiêu
+ Khả năng chống oxy hoá:
Hàm lượng polyphenol tổng
Hoạt tính chống oxy hố dựa vào khả năng bắt gốc tự do DPPH
2.3.6 Thí nghiệm 3: Xác định khả năng chống oxy hoá của sản phẩm sau thanh trùng.
Mục đích: Xác định được khả năng chống oxy hố cịn lại của sản phẩm sau thanh
Thông số cố định:
- Giống tỏi (lựa chọn từ thí nghiệm 1), % enzyme pectinase bổ sung so với khối lượng mẫu (lựa chọn từ thí nghiệm 2.1), nhiệt độ dịch hoá (lựa chọn từ thí nghiệm 2.2), thời gian dịch hố (lựa chọn từ thí nghiệm 2.3).
- Thanh trùng ở nhiệt 90oC, thời gian 4 phút.
- Dịch tỏi đen có pH = 4,5 - thuộc sản phẩm có giá trị pH thấp nên khả năng kháng nhiệt của vi sinh vật kém nên dễ dàng bị tiêu diệt khi thanh trùng [52].
- Hiện nay, chưa có tài liệu nghiên cứu liên quan về dịch tỏi đen cũng như điều kiện thanh trùng của sản phẩm. Chúng em lựa chọn thời gian và nhiệt độ thanh trùng dựa trên nghiên cứu đối với sản phẩm có độ pH tương ứng. Trong nghiên cứu về chế độ thanh trùng sản phẩm nước trái cây hỗn hợp (sơ ri, khóm, chanh dây) của Lê Mỹ Hồng khi sản phẩm được thanh trùng ở nhiệt độ 85oC với tất cả các thời gian giữ nhiệt, và thanh trùng ở 90oC với thời gian giữ nhiệt 2 phút (giá trị PU nhỏ hơn 26,5 phút) sau 6 tuần bảo quản đều có vi sinh vật phát triển vượt quá giới hạn cho phép trong sản phẩm; nhưng ở các chế độ thanh trùng còn lại, sau 6 tuần bảo quản vi sinh vẫn còn trong giới hạn cho phép. Vì vậy sản phẩm thanh trùng ở nhiệt độ 90oC (thời gian giữ nhiệt lớn hơn hoặc bằng 4 phút) có giá trị thanh trùng PU lớn hơn 34,4 phút, sản phẩm có thể bảo quản 6 tuần vẫn chưa có dấu hiệu hư hỏng, điều này nói lên sản phẩm ổn định trong thời gian bảo quản [53].
Cách tiến hành
- Sau khi tiến hành dịch hố mẫu ở các điều kiện thích hợp đã được xác định từ các thí nghiệm trước, mẫu nước ép tỏi đen sẽ được vô hoạt enzyme ở 90 oC, trong 5 phút nhằm mục đích bất hoạt enzyme. Sau đó, tiến hành q trình lọc mẫu bằng máy lọc chân không. Phần dịch thu được sẽ được rót chai thể tích 150ml rồi thanh trùng hở ở điều kiện 90oC, thời gian 4 phút.
- Nhiệt độ ban đầu của mẫu nước ép tỏi đen là 31oC.
- Nhiệt độ ban đầu của nước dùng để thanh trùng là 33oC. Cho các chai nước ép tỏi đen vào nồi thanh trùng. Tiến hành giai đoạn nâng nhiệt của nồi nước lên 90oC, tổng thời gian của quá trình nâng nhiệt là 15 phút. Sau khi nâng nhiệt độ của nồi nước lên 90oC thì tiến hành giai đoạn giữ nhiệt trong 4 phút để thanh trùng. Sau 4 phút, tiến hành giai đoạn hạ nhiệt từ 90oC về lại nhiệt độ phòng trong thời gian 60 phút.
- Sau đó, tiến hành các thí nghiệm xác định khả năng chống oxy hoá và xác định hàm lượng các chất chống oxy hố cịn lại trong sản phẩm sau khi thanh trùng. Kiểm tra hàm lượng vi sinh vật sau thanh trùng.
- Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần
- Hàm lượng polyphenol tổng của dịch trích sẽ được xác định ở thời điểm trước và sau khi thanh trùng.
- Khả năng chống oxy hoá của dịch sẽ được xác định ở thời điểm trước và sau khi thanh trùng.
- Xác định khả năng chống oxy hoá của dịch tỏi sau khi thanh trùng, đồng thời kiểm tra hàm lượng vi sinh vật có trong mẫu để đánh giá ảnh hưởng của chế độ thanh trùng.
Hàm mục tiêu:
+ Khả năng chống oxy hoá
Hàm lượng polyphenol tổng
Hoạt tính chống oxy hố dựa vào khả năng bắt gốc tự do DPPH + Kiểm nghiệm vi sinh
Hàm lượng E.coli
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng
- Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của II Sook Choi và cộng sự (2014) [6].
- Nguyên tắc: phương pháp Folin-Ciocalteu dùng để đo tổng lượng polyphenol dựa vào
việc vận chuyển electron từ các phân tử polyphenol sang thuốc thử Folin-Ciocalteu. Chất nhận điện tử trong thuốc thử là Mo6+ (màu vàng) và Vo6+ sẽ chuyển sang Mo5+ (màu xanh) và Vo5+ (màu xanh). Hấp thu cực đại ở bước sóng 750 nm [6]. Acid gallic được sử dụng như là chất chuẩn tham khảo và kết quả được quy tương đương theo số mg acid gallic/1 gam của nguyên liệu (mg GAE/g chất khơ) [55]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên vào khả năng khử gốc tự do 1,1 –
diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
- Là phương pháp được xác định theo phương pháp của II Sook Choi và cộng sự (2014) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Khả năng bắt gốc tự do DPPH được thể hiện thông qua sự giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm, do gốc DPPH bị khử bởi các thành phần kháng oxy hóa trong mẫu khảo sát.
- Nguyên tắc: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền có màu tím đậm.
Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bước sóng 517nm và sản phẩm khử của nó là 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng nhạt. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc tự do DPPH• bằng cách cho hydro, đình chỉ q trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [57].
Hình 2.10. Cơ chế hoạt động của DPPH và chất kháng oxy hóa
- Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức:
- Trong đó:
Abs control: là độ hấp thu của mẫu trắng gồm DPPH và Methanol, được đo ở 0 phút.
Abs test: là độ hấp thu của mẫu thử gồm DPPH và dịch trích, được đo sau 30 phút giữ trong tối.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Lựa chọn nguyên liệu làm nƣớc tỏi đen thích hợp trong ba loại tỏi từ các vùng: Lý Sơn, Sóc Trăng, Phan Rang để sử dụng trong quy trình sản xuất. Lý Sơn, Sóc Trăng, Phan Rang để sử dụng trong quy trình sản xuất.
Hình 3.1 trình bày kết quả khảo sát ảnh hưởng của các loại tỏi đến hàm lượng polyphenol tổng có trong dịch thu được từ tỏi đen. Kết quả cho thấy, với cùng điều kiện xử lý, dịch hố thì hàm lượng polyphenol tổng của tỏi Lý Sơn là cao nhất với 19,6 mg GAE/g chất khô. Tiếp đến là tỏi Phan Rang với lượng polyphenol tổng là 17,12 mg GAE/g chất khơ.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của giống tỏi đến hàm lượng polyphenol tổng của dịch tỏi đen
Hình 3.2 chỉ ra rằng tỏi Phan Rang có khả năng chống oxy hoá cao nhất trong ba loại tỏi được thể hiện qua việc xác định khả năng thu nhặt gốc tự do DPPH. Kết quả cho thấy khả năng kháng oxy hóa của dịch tỏi đen Phan Rang đạt 45,45%.
0 5 10 15 20 25
Lý Sơn Sóc Trăng Phan Rang
Hàm lư ợ ng po ly ph en o l tổn g m gG A E /g chấ t khơ Giống Tỏi
Hình 3.2. Ảnh hưởng của giống tỏi đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch tỏi đen
Hình 3.3 cho thấy hàm lượng chất khơ hồ tan của tỏi ở các vùng có sự khác nhau rõ rệt. Cụ thể hàm lượng chất khơ hồ tan của tỏi Lý Sơn là cao nhất đạt 9,7 0Brix. Tỏi Sóc Trăng có hàm lượng chất khơ hồ tan đứng thứ hai với 7,40Brix và thấp nhất là tỏi Nha Trang với 5,90Brix.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của giống tỏi hàm lượng chất khơ hồ tan của dịch tỏi đen
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Lý Sơn Sóc Trăng Phan Rang
Kh ả n ăng khử g ố c tự d o DP P H (% ) Giống tỏi 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
Lý Sơn Sóc Trăng Phan Rang
H{ m lư ợ ng ch ất kh ơ h o{ t an Giống tỏi
Sở dĩ, có sự khác biệt về hàm lượng polyphenol tổng và khả năng chống oxy hố của ba loại tỏi vì các điều kiện thổ nhưỡng, trồng trọt và bảo quản sau thu hoạch sẽ ảnh hưởng đến các tính chất hố học của tỏi [12].
Vì vậy, chúng em chọn tỏi Phan Rang với hàm lượng polyphenol trong dịch đạt 17,12 mg GAE/g chất khô và khả năng kháng oxy hóa trong dịch đạt 45,45% để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1. Hàm lƣợng polyphenol tổng thu đƣợc trong dịch tỏi đen của ba giống tỏi khác nhau
Giống tỏi Hàm lƣợng polyphenol tổng (mg GAE/g chất khô)
Lý Sơn 19,60 ± 0,13a
Sóc Trăng 16,84 ± 1,01b
Phan Rang 17,12 ± 0,47b
Bảng 3.2. Khả năng chống oxy hoá của dịch tỏi đen từ ba giống tỏi khác nhau
Giống tỏi Khả năng chống oxy hoá (%)
Lý Sơn 31,31 ± 0,88a
Sóc Trăng 21,72 ± 3,15c
Phan Rang 45,45 ± 4,00b
Bảng 3.3. Hàm lƣợng chất khơ hồ tan của dịch tỏi đen từ ba giống tỏi khác nhau
Giống tỏi Hàm lƣợng chất khơ hồ tan (oBrix)
Lý Sơn 9,7 ± 0,29a
Sóc Trăng 7,4 ± 0,21b
3.2 Xác định các điều kiện dịch hoá
3.2.1 Xác định % enzyme pectinase bổ sung trong q trình dịch hố