Tên hóa chất Cơng thức hóa
học Xuất xứ Mục đích sử dụng
Pectinex Ultra SP-L Singapore Tăng hiệu suất quá
trình dịch hố
Thuốc thử Folin-Ciocalteu Trung Quốc
Xác định hàm lượng polyphenol tổng
Acid Gallic C7H6O5 Đức
Sodium carbonate Na2CO3 Trung Quốc
1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl C18 H12N5O6 Đức Xác định khả năng chống oxy hoá Trolox C14H18O4 Mỹ Cồn 99o C2H5OH Trung Quốc 2.2 Dụng cụ và thiết bị Bảng 2.2. Danh sách thiết bị sử dụng
Thiết bị Model Xuất Xứ
Cân phân tích 4 số lẻ Sartorius QUINTIX224-1S Đức
Cân phân tích 2 số lẻ Sartorius TE612/SN Đức
Máy sinh tố Philips HR - 2068 Trung Quốc
Thiết bị sấy SHELLAB
Model : 1330 FX Mỹ
Máy lọc chân không
Thể tích phiểu lọc 300ml- Thể tích bình chứa 1000ml Bơm chân không Gast. Model: DOA-P604-BN Trung Quốc Tủ ấm lạnh có lắc Contherm Serial No: 13361 New Zealand
Máy lên men tỏi đen Model: VN 01 Việt Nam
Khúc xạ kế đo độ brix
Trans Instruments HS1050/1051
Singapore
Một số dụng cụ thông thường khác như: erlen, becher, pipet, ống nghiệm, đũa thuỷ tinh, cuvet thuỷ tinh.
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất tỏi đen từ tỏi tƣơi
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình sản xuất tỏi đen từ tỏi tươi
Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu: Tỏi tươi nhiều nhánh được nhập từ 3 vùng trồng tỏi Lý Sơn, Sóc Trăng,
Phan Rang. Yêu cầu tỏi nguyên vẹn, không dập nát, sâu mọt, chất lượng đạt đồng đều.
Xử lý sơ bộ: Tỏi được làm sạch đất cát. Cắt bỏ phần rễ, cuống. Và tiến hành bóc vỏ sản
phẩm. Mục đích của cơng đoạn bóc vỏ là để làm giảm thời gian của quá trình lên men tỏi tươi thành tỏi đen. Từ đó giúp tiết kiệm thời gian, chi phí sản xuất.
Lên men: Sau khi xử lý sơ bộ, ta tiến hành quá trình lên men tỏi tươi bằng máy làm tỏi
với các thông số nhiệt độ, thời gian, độ ẩm đã được cố định trước. Cụ thể, tỏi đen sẽ được lên men ở nhiệt độ 75oC, độ ẩm 90%, thời gian 15 ngày. Theo các nghiên cứu trước đã công bố, điều kiện lên men trên cho hàm lượng polyphenol tổng và khả năng chống oxy hoá cao (8,07 ± 0,21 g GAE∙kg -1 DW và 82,21 ± 0,88%) [46].
Tỏi tươi
Xử lý sơ bộ
Lên men
2.3.2 Sơ đồ quy trình sản xuất nƣớc tỏi đen
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình sản xuất nước tỏi đen
Thuyết minh quy trình
- Nghiền: tỏi đen sau khi được lựa chọn được nghiền nhuyễn bằng máy xay.
- Dịch hoá: tiến hành dịch hoá tỏi đen với nước với tỉ lệ tỏi : nước tương ứng là 1:10.
Khảo sát nhiệt độ dịch hoá (4h, 5h, 6h, 7h, 8h ), nhiệt độ (40oC, 45 oC, 50 oC, 55 oC, 60 oC), nồng độ pectinase (1%, 2%, 3%, 4%, 5%).
- Đun sôi: sau khi xử lý bằng enzyme pectinase, dịch tỏi đen được đun sôi ở 90oC trong 5
phút nhằm mục đích vơ hoạt enzyme pectinase. Tỏi đen Nghiền Dịch hố Đun sơi Làm nguội Lọc 100oC, 5 phút Lọc Rót chai Thanh trùng Dán nhãn Sản phẩm 90oC, 4phút
- Lọc: Lọc dung dịch nước tỏi đen bằng màng lọc, bỏ phần bã. Phần nước lọc được sử
dụng ở các công đoạn sau.
Rót chai: Cho dung dịch tỏi đen vào trong chai thuỷ tinh thể tích 200ml. Rồi sau đó tiến
hành ghép mí sản phẩm.
Thanh trùng: Thanh trùng sản phẩm bằng phương pháp thanh trùng hở ở nhiệt độ 90oC,
thời gian 4 phút.
2.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát các thông số trong giai đoạn dịch hố
Khảo sát 3 thơng số: % enzyme pectinse bổ sung, nhiệt độ, thời
gian.
Xác định khả năng chống oxy hoá
của sản phẩm sau thanh trùng
Sản phẩm: nước tỏi đen
Xác định hàm lượng polyphenol tổng Khả năng chống oxy hoá theo phương pháp
DPPH
Hàm lượng chất khơ hồ tan
Kiểm nghiệm vi sinh
Hàm lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí Hàm lượng E.coli Nguyên liệu Tỏi đen (Lý Sơn, Sóc Trăng, Phan Rang) Xác định hàm lượng polyphenol tổng Khả năng chống oxy hoá theo phương pháp
DPPH Xác định hàm lượng polyphenol tổng Khả năng chống oxy hoá theo phương pháp
DPPH
Hàm lượng chất khơ hồ tan Hàm lượng chất khơ hồ tan
2.3.4 Thí nghiệm 1: Lựa chọn nguyên liệu làm nƣớc tỏi đen thích hợp trong ba loại tỏi từ các vùng: Lý Sơn, Sóc Trăng, Phan Rang để sử dụng trong quy trình sản xuất
Hình 2.9. Quy trình lựa chọn nguyên liệu làm nước tỏi đen
Mục đích: Lựa chọn được nguyên liệu (tỏi đen được lên men từ tỏi trồng ở ba
vùng) có khả năng chống oxy hố cao nhất để đưa vào trong quy trình sản xuất nước tỏi đen. Tỏi tươi Tỏi đen Nghiền Dịch hố Đun sơi Làm nguội Lọc 90oC, 5 phút Khảo sát các chỉ tiêu
- Chọn % enzyme pectinase bổ sung theo khối lượng mẫu là 3%, nhiệt độ 45oC, thời gian 5 giờ. Một số nghiên cứu dịch hoá đối với tỏi đen cũng chọn các khoảng khảo sát tương tự [33], [45].
- Để có thể đảm bảo độ đồng nhất và ổn định của nguyên liệu, một lượng lớn nguyên liệu được thu gom một lần. Sau đó tiến hành bóc vỏ, lên men thành tỏi đen rồi sau đó bảo quản ở nhiệt độ -50C.
- Theo Cowan (1999) dung mơi thích hợp để chiết các hợp chất phenolic là nước, ethanol và methanol [47]. Nhưng vì sản phẩm là thức uống dinh dưỡng nên trong nghiên cứu ta chọn dung môi là nước để tiến hành khảo sát. Tỉ lệ giữa cơ chất và nước lựa chọn là 1:10 (g/ml) [48], [49].
Đối tƣợng khảo sát
- Nguồn nguyên liệu đầu vào đóng vai trò quyết định đối với chất lượng của chuỗi sản xuất. Mỗi loại tỏi khác nhau, được trồng ở các điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu khác nhau sẽ có các tính chất vật lý, hố học khác nhau cũng như sự khác biệt về hàm lượng các hoạt chất sinh học bên trong [12]. Cho nên việc lựa chọn đối tượng khảo sát là rất cần thiết. - Ở phạm vi của nghiên cứu này lựa chọn tỏi nhiều nhánh của ba vùng Lý Sơn, Phan Rang, Sóc Trăng. Đây là ba vùng trồng tỏi lớn, có sản lượng ổn định.
- Việc lựa chọn tỏi nhiều nhánh nhằm mục đích làm giảm chi phí thu mua nguyên liệu. Đồng thời việc bóc vỏ tỏi trước khi lên men sẽ giúp rút ngắn thời gian lên men so với tỏi cơ đơn từ đó hạ giá thành sản phẩm.
Cách tiến hành
- Tỏi đen sau quá trình lên men được bảo quản ở điều kiện -4oC. Khi tiến hành thí nghiệm sẽ được nghiền bằng máy xay nhằm mục đích phá vỡ tế bào, tăng diện tích tiếp xúc của enzyme và cơ chất. Sau đó, tiến hành cân định lượng 2g tỏi đen hoà cùng 200ml nước cho vào becker 250ml, bổ sung 3% enzyme pectinase so với khối lượng mẫu. Mẫu được ủ trong tủ ấm ở 45 oC, thời gian dịch hoá là 5 giờ.
- Sau 5h, tiến hành vô hoạt enzyme bằng cách đun cách thuỷ 90oC, 5 phút. Sau khi vô hoạt, tiến hành lọc dịch tỏi đen bằng thiết bị lọc chân không. Phần dịch lọc thu được sẽ được bảo quản lạnh ở nhiệt độ -4oC.
- Sau đó, tiến hành các thí nghiệm xác định khả năng chống oxy hoá của dịch tỏi đen của ba loại tỏi: Lý Sơn, Phan Rang, Sóc Trăng.
- Hàm lượng polyphenol tổng của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hố.
- Khả năng chống oxy hố của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hố. - Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.
- Điều kiện dịch hố nào cho dịch trích khả năng chống oxy hố cao nhất sẽ được chọn để tiếp tục nghiên cứu
Hàm mục tiêu
+ Khả năng chống oxy hoá:
Hàm lượng polyphenol tổng
Hoạt tính chống oxy hố dựa vào khả năng bắt gốc tự do DPPH
2.3.5 Thí nghiệm 2: Xác định các thơng số dịch hố.
Mục đích: tìm được điều kiện dịch hố thích hợp để thu được dịch trích có hoạt
tính kháng oxy hố cao nhất.
- Theo nghiên cứu đã công bố, % enzyme pectinase sử dụng trong giai đoạn dịch hoá tỏi đen là 3% (theo khối lượng mẫu) nên chúng em chọn tỉ lệ enzyme pectinase bổ sung với % thấp nhất là ở điều kiện thường (0%), với bước nhảy là 1%, % enzyme pectinase bổ sung nhiều nhất là 5% (theo khối lượng mẫu) [33].
- Chọn nhiệt độ thấp nhất cho khảo sát là ở điều kiện 40oC, với bước nhảy 5oC, nhiệt độ cao nhất là 60oC. Một số nghiên cứu cũng chọn khoảng nhiệt độ tương tự [45]. Ngoài
ra, nếu nhiệt độ q trình dịch hố q cao có thể làm tăng tốc độ phản ứng oxy hố của các hợp chất phenolic dẫn đến hàm lượng bị giảm đi [51].
- Lựa chọn thời gian dịch hoá trong khoảng 4-8 giờ. Với bước nhảy là 1 giờ.
Tiến hành
- Kế hoạch thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 2.3. Bảng kế hoạch thí nghiệm xác định các thơng số trong giai đoạn dịch hố tỏi đen
Thí nghiệm Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định
2.1 Xác định % enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu).
% enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu): 1%, 2%, 3%, 4%, 5%.
- Thời gian dịch hoá: 5 giờ. - Nhiệt độ dịch hoá: 45oC. - Giống tỏi: Lựa chọn từ thí nghiệm 1. 2.2 Xác định nhiệt độ thích hợp của q trình dịch hố Nhiệt độ dịch hoá: 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC
-Thời gian dịch hoá: 5 giờ. - Giống tỏi: Lựa chọn từ thí nghiệm 1.
- % enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu): Lựa chọn từ thí nghiệm 2.1. -
2.3 Xác định thời gian thích hợp của quá trình dịch hố
Thời gian thích hợp: 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ, 8 giờ.
- Giống tỏi: Lựa chọn từ thí nghiệm 1.
- % enzyme pectinase bổ sung (theo khối lượng mẫu): lựa chọn từ thí nghiệm 2.1.
- Nhiệt độ dịch hoá: lựa chọn từ thí nghiệm 2.2.
- Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần
- Hàm lượng polyphenol tổng của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hố.
- Khả năng chống oxy hố của dịch trích sẽ được xác định sau mỗi thí nghiệm dịch hố. - Điều kiện dịch hố nào cho dịch trích khả năng chống oxy hố cao nhất sẽ được chọn để tiếp tục nghiên cứu
Hàm mục tiêu
+ Khả năng chống oxy hoá:
Hàm lượng polyphenol tổng
Hoạt tính chống oxy hố dựa vào khả năng bắt gốc tự do DPPH
2.3.6 Thí nghiệm 3: Xác định khả năng chống oxy hoá của sản phẩm sau thanh trùng.
Mục đích: Xác định được khả năng chống oxy hố cịn lại của sản phẩm sau thanh
Thông số cố định:
- Giống tỏi (lựa chọn từ thí nghiệm 1), % enzyme pectinase bổ sung so với khối lượng mẫu (lựa chọn từ thí nghiệm 2.1), nhiệt độ dịch hố (lựa chọn từ thí nghiệm 2.2), thời gian dịch hố (lựa chọn từ thí nghiệm 2.3).
- Thanh trùng ở nhiệt 90oC, thời gian 4 phút.
- Dịch tỏi đen có pH = 4,5 - thuộc sản phẩm có giá trị pH thấp nên khả năng kháng nhiệt của vi sinh vật kém nên dễ dàng bị tiêu diệt khi thanh trùng [52].
- Hiện nay, chưa có tài liệu nghiên cứu liên quan về dịch tỏi đen cũng như điều kiện thanh trùng của sản phẩm. Chúng em lựa chọn thời gian và nhiệt độ thanh trùng dựa trên nghiên cứu đối với sản phẩm có độ pH tương ứng. Trong nghiên cứu về chế độ thanh trùng sản phẩm nước trái cây hỗn hợp (sơ ri, khóm, chanh dây) của Lê Mỹ Hồng khi sản phẩm được thanh trùng ở nhiệt độ 85oC với tất cả các thời gian giữ nhiệt, và thanh trùng ở 90oC với thời gian giữ nhiệt 2 phút (giá trị PU nhỏ hơn 26,5 phút) sau 6 tuần bảo quản đều có vi sinh vật phát triển vượt quá giới hạn cho phép trong sản phẩm; nhưng ở các chế độ thanh trùng còn lại, sau 6 tuần bảo quản vi sinh vẫn cịn trong giới hạn cho phép. Vì vậy sản phẩm thanh trùng ở nhiệt độ 90oC (thời gian giữ nhiệt lớn hơn hoặc bằng 4 phút) có giá trị thanh trùng PU lớn hơn 34,4 phút, sản phẩm có thể bảo quản 6 tuần vẫn chưa có dấu hiệu hư hỏng, điều này nói lên sản phẩm ổn định trong thời gian bảo quản [53].
Cách tiến hành
- Sau khi tiến hành dịch hố mẫu ở các điều kiện thích hợp đã được xác định từ các thí nghiệm trước, mẫu nước ép tỏi đen sẽ được vô hoạt enzyme ở 90 oC, trong 5 phút nhằm mục đích bất hoạt enzyme. Sau đó, tiến hành q trình lọc mẫu bằng máy lọc chân khơng. Phần dịch thu được sẽ được rót chai thể tích 150ml rồi thanh trùng hở ở điều kiện 90oC, thời gian 4 phút.
- Nhiệt độ ban đầu của mẫu nước ép tỏi đen là 31oC.
- Nhiệt độ ban đầu của nước dùng để thanh trùng là 33oC. Cho các chai nước ép tỏi đen vào nồi thanh trùng. Tiến hành giai đoạn nâng nhiệt của nồi nước lên 90oC, tổng thời gian của quá trình nâng nhiệt là 15 phút. Sau khi nâng nhiệt độ của nồi nước lên 90oC thì tiến hành giai đoạn giữ nhiệt trong 4 phút để thanh trùng. Sau 4 phút, tiến hành giai đoạn hạ nhiệt từ 90oC về lại nhiệt độ phòng trong thời gian 60 phút.
- Sau đó, tiến hành các thí nghiệm xác định khả năng chống oxy hoá và xác định hàm lượng các chất chống oxy hố cịn lại trong sản phẩm sau khi thanh trùng. Kiểm tra hàm lượng vi sinh vật sau thanh trùng.
- Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần
- Hàm lượng polyphenol tổng của dịch trích sẽ được xác định ở thời điểm trước và sau khi thanh trùng.
- Khả năng chống oxy hoá của dịch sẽ được xác định ở thời điểm trước và sau khi thanh trùng.
- Xác định khả năng chống oxy hoá của dịch tỏi sau khi thanh trùng, đồng thời kiểm tra hàm lượng vi sinh vật có trong mẫu để đánh giá ảnh hưởng của chế độ thanh trùng.
Hàm mục tiêu:
+ Khả năng chống oxy hoá
Hàm lượng polyphenol tổng
Hoạt tính chống oxy hố dựa vào khả năng bắt gốc tự do DPPH + Kiểm nghiệm vi sinh
Hàm lượng E.coli
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng
- Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của II Sook Choi và cộng sự (2014) [6].
- Nguyên tắc: phương pháp Folin-Ciocalteu dùng để đo tổng lượng polyphenol dựa vào
việc vận chuyển electron từ các phân tử polyphenol sang thuốc thử Folin-Ciocalteu. Chất nhận điện tử trong thuốc thử là Mo6+ (màu vàng) và Vo6+ sẽ chuyển sang Mo5+ (màu xanh) và Vo5+ (màu xanh). Hấp thu cực đại ở bước sóng 750 nm [6]. Acid gallic được sử dụng như là chất chuẩn tham khảo và kết quả được quy tương đương theo số mg acid gallic/1 gam của nguyên liệu (mg GAE/g chất khô) [55].
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên vào khả năng khử gốc tự do 1,1 –
diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
- Là phương pháp được xác định theo phương pháp của II Sook Choi và cộng sự (2014) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Khả năng bắt gốc tự do DPPH được thể hiện thông qua sự giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm, do gốc DPPH bị khử bởi các thành phần kháng oxy hóa trong mẫu khảo sát.
- Nguyên tắc: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền có màu tím đậm.
Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bước sóng 517nm và sản phẩm khử của nó là 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng nhạt. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc tự do DPPH• bằng cách cho hydro, đình chỉ q trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [57].
Hình 2.10. Cơ chế hoạt động của DPPH và chất kháng oxy hóa
- Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức:
- Trong đó:
Abs control: là độ hấp thu của mẫu trắng gồm DPPH và Methanol, được đo