1.3.1 Vai trò phytase
Phytase là một enzyme có thể giải phóng phytate đƣợc đính phosphore (P) để sử dụng trong đƣờng tiêu hoá của vật nuôi dạ dày đơn, là một trong số enzyme quan trọng của công nghiệp sản xuất thức n gia súc. Bổ sung phytase vào thức n vật ni có thể làm giảm nhu cầu cung cấp P vô cơ và giảm thấp sự ài tiết P vào trong phân, từ đó hạn chế đƣợc ơ nhiễm P vào trong đất và trong nƣớc ngầm. Trong thực vật, 50-80% tổng lƣợng phosphorus (P) tồn tại dƣới dạng phytate hay acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexadihydrogenphosphate) rất khó tiêu hố và hấp thu [37]. Vì thế, lƣợng P hữu dụng trong thực vật rất thấp. Bên cạnh đó, phytate hoặc acid phytic còn tạo liên kết chặt chẽ với các khoáng kim loại, axit amin, protein, tinh ột, gây ra hiệu ứng kháng dinh dƣỡng, làm giảm khả n ng tiêu hóa của các dƣỡng chất này.
1.3.2 Tác dụng phytase
Sản xuất Phytase từ vi sinh vật nhất là từ vi khuẩn rất khó kiểm sốt vì chúng ta chƣa giải thích đƣợc rõ về cơ chế tổng hợp phytase đặc iệt là các gene điều khiển sinh tổng hợp phytase luôn iến đổi. Tùy theo nhóm vi sinh vật, giống lồi, điều kiện mơi trƣờng nuôi cấy, cơ chất, … sẽ ảnh hƣởng đến n ng suất và hoạt tính của phytase [38]. Enzym phytase có thể làm t ng hấp thụ P trong cơ thể vật nuôi thêm 60% và đƣợc dùng nhƣ là chất ổ sung ắt uộc cho thức n ch n nuôi ở Châu Âu, một số nƣớc của Đông Nam Á, Hàn Quốc, Nhật, Đài oan để giảm tác hại đến môi
22
trƣờng do P từ phân vật nuôi thải ra. Phytase ổ sung vào thành phần thức n với một lƣợng nhỏ nhƣng đem lại hai lợi ích: hạ giá thành sản phẩm thông qua việc tận dụng lƣợng Ca, P, Fe, protein dễ tiêu, giải phóng n ng lƣợng, ... và chỉ còn thải một lƣợng P rất thấp qua phân nên giảm thiểu tối đa mùi hôi và sự ô nhiễm môi trƣờng. Sử dụng phytase để phân giải P trong thức n, không cần ổ sung ột xƣơng, giảm thiểu sự thất thốt P vào mơi trƣờng, chỉ cần ổ sung 250 đến 1.000 UI phytase/kg thức n có thể thay thế hồn tồn lƣợng ột xƣơng ổ sung [39].
1.4 Sấ phun
Sấy phun là một cơng nghệ sấy hiện đại có tác dụng chuyển nguyên liệu từ dạng lỏng sang dạng ột một cách đơn giản. Công nghệ sấy phun đƣợc áp dụng do đặc tính dễ kiểm sốt nhiệt độ và định hình hạt sản phẩm một cách chính xác. Cơng nghệ này giúp tách ẩm khỏi vật liệu có độ ẩm rất cao một cách nhanh chóng, giúp t ng độ ền và ảo quản sản phẩm đƣợc lâu hơn.
Đặc tính ƣu việt của cơng nghệ sấy phun là nhiệt độ sản phẩm sấy thấp, sản phẩm đƣợc thu nhận có cấu trúc hạt nhỏ, độ hồ tan lớn. Thời gian sấy nhanh nên giảm thiểu sự thất thoát các chất dinh dƣỡng có trong sản phẩm, ảo tồn đƣợc các chất dinh dƣỡng mẫn cảm với nhiệt độ cao. Bên cạnh đó, chi phí vận hành và ảo dƣỡng thiết ị không quá cao. [40]
1.4.1 Nguyên lý của phương pháp sấy phun
Một hệ phân tán mịn của nguyên liệu từ chất lỏng hòa tan, nhũ tƣơng, huyền phù đã đƣợc cô đặc trƣớc (40 - 60% ẩm) đƣợc phun để hình thành những giọt mịn, rơi vào trong dịng khí nóng cùng chiều hoặc ngƣợc chiều ở nhiệt độ khoảng 150 - 300ºC trong uồng sấy lớn. Kết quả là hơi nƣớc đƣợc ốc đi nhanh chóng. Các hạt sản phẩm đƣợc tách ra khỏi tác nhân sấy nhờ một hệ thống thu hồi riêng. [41]
23
1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình sấy
+ Nồng độ chất khơ của ngun liệu
Nồng độ cao: Giảm đƣợc thời gian ốc hơi nhƣng lại t ng độ nhớt của nguyên liệu, gây khó kh n cho q trình sấy phun.
Nồng độ thấp: Tốn nhiều thời gian và n ng lƣợng cho quá trình. Thực tế nồng độ vào khoảng: 45- 52%. [42]
+ Nhiệt độ tác nhân sấy:
Đây là yếu tố ảnh hƣởng quyết định đến độ ẩm của sản phẩm sau khi sấy phun. Khi cố định thời gian sấy, độ ẩm của ột sản phẩm thu đƣợc sẽ giảm đi nếu t ng nhiệt độ tác nhân sấy. [43]
Tuy nhiên, việc gia t ng nhiệt độ cao có thể gây phân hủy một số cấu tử trong nguyên liệu mẫn cảm với nhiệt và làm t ng mức tiêu hao n ng lƣợng cho tồn ộ q trình.
+ Kích thƣớc, số lƣợng và quỹ đạo chuyển động của các hạt nguyên liệu trong uồng sấy.
Các yếu tố khác cũng ảnh hƣởng đến quá trình sấy phun là tốc độ ơm đƣa dòng nguyên liệu vào cơ cấu phun sƣơng, lƣu lƣợng khơng khí nóng vào uồng sấy, cấu tạo và kích thƣớc uồng sấy …
C n cứ trên những thơng tin tìm hiểu đƣợc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng dịch thủ ph n Protein từ tr n qu (Perionyx excavatus)
và ch phẩm enz me ph t se làm nguồn dinh dƣỡng ổ sung cho heo” nhằm
cải thiện chất lƣợng sản phẩm thức n ch n ni hiện nay, từ đó giúp heo con lớn nhanh, khỏe mạnh và thân thiện môi trƣờng.
24
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
2.1.1 Địa điểm và thời gian
uận v n đƣợc thực hiện tại:
Phịng T3.09, T3.08 Viện Cơng nghệ sinh học và thực phẩm, trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh – 12 Nguyễn V n Bảo, phƣờng 4, quận Gò Vấp, Tp. Hồ Chí Minh.
Phịng thí nghiệm F4.03 của Viện công nghệ Sinh học và Thực phẩm – Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.
Cơng ty Cổ phần BV pharma - Ấp 2, xã Tân Thạnh Tây, huyện Củ Chi, Tp. Hồ Chí Minh.
Trang trại ch n nuôi V nh Khánh thuộc Công ty Cổ phần Xuất nhập khẩu nông sản thực phẩm An Giang – ấp Trung Bình Tiến, xã V nh Trạch, huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang.
25
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ
*Thiết ị
STT Tên thi t ị Model Hãng Xuất xứ
1 Máy khuấy từ gia
nhiệt 10 điểm MS-H-S10 SCLOGEX Mỹ
2 Máy đo pH Walklab HP9000 Trans Instruments Singapaore
3 Máy xay DGD-335 Rozabi Trung Quốc
4 Máy ly tâm lạnh 1730R Labogene Đan Mạch
5 Cân đồng hồ
dùng để cân heo Nhơn Hòa Việt Nam
6 Cân phân tích CP324S Sartorius Đức
7 Tủ hút TECHLAB Việt Nam
8 Lò nung UAF Lenton Anh
9 Máy đo quang GENESYS 10
UV
Thermo Electron
Corporation Mỹ
10 Bếp điện GL-072A Gali Việt Nam
11 Máy sấy phun SD - BASIC LabPlant Anh
26 *Dụng cụ STT Tên dụng cụ Xuất xứ 1 Becher Đức 2 Erlen Đức 3 Ống đong Đức
4 Ống nghiệm Trung Quốc
5 Micropipette Trung Quốc
6 Eppendorf Việt Nam
7 ồng heo nặng 25 kg dùng để ắt heo lên cân Việt Nam
8 G ng tay y tế. Việt Nam
9 Dụng cụ lấy và chứa mẫu phân Việt Nam
10 Ống tiêm 10 ml, ống chứa mẫu máu Việt Nam
11 Buống đếm hồng cầu Anh
12 Chén nung Trung Quốc
13 Cuvet Việt Nam
14 Thùng giữ lạnh Việt Nam
15 Đũa thủy tinh Việt Nam
2.1.3 Hóa chất
Nƣớc cất.
Rỉ đƣờng.
NaCl.
Hóa chất sử dụng khảo sát nồng độ đƣờng ổ sung :
Dung dịch đệm 0,5M, pH = 6,6, trộn A:B = 1:1.
Dung dịch A: hòa tan 89,535g Na2HPO4. 12H2O với nƣớc thành 500ml.
Dung dịch B: hòa tan 39,0025g NaH2PO4. 2H2O với nƣớc thành 500ml.
Ion kim loại MnCl2 0,1M: hòa tan 3,958g MnCl2.4H2O với nƣớc thành 200ml. Hóa chất sử dụng khảo sát nồng độ enzyme :
27
Dung dịch đệm 0,5M, pH = 6,6, trộn A:B = 1:1.
Dung dịch A: hòa tan 89,535g Na2HPO4. 12H2O với nƣớc thành 500ml.
Dung dịch B: hòa tan 39,0025g NaH2PO4. 2H2O với nƣớc thành 500ml.
Ion kim loại MnCl2 0,1M: hịa tan 3,958g MnCl2.4H2Ovới nƣớc thành 200ml.
Hóa chất sử dụng khảo sát cofactor :
Dung dịch đệm 0,5M, pH = 6,6, trộn A:B = 1:1.
Dung dịch A: hòa tan 89,535g Na2HPO4. 12H2O với nƣớc thành 500ml.
Dung dịch B: hòa tan 39,0025g NaH2PO4. 2H2O với nƣớc thành 500ml.
Ion kim loại MnCl2 0,1M: hòa tan 3,958g MnCl2.4H2Ovới nƣớc thành 200ml.
Ion kim loại: pha dung dịch stock 0,1M.
MgCl2: hoà tan 1,0165g MgCl2 với nƣớc thành 50ml
MnCl2: hoà tan 0,9896g MnCl2 với nƣớc thành 50ml ZnSO4: hoà tan 1,4379g ZnSO4 với nƣớc thành 50ml
CaCl2:hòa tan 0,5545g CaCl2 với nƣớc thành 50ml
FeCl2: hòa tan 0,9941g FeCl2 với nƣớc thành 50ml
FeCl3: hòa tan 1,3517g FeCl3 với nƣớc thành 50ml
AlCl3: hòa tan 1,2072g AlCl3 với nƣớc thành 50ml
Hóa chất sử dụng khảo sát nồng độ cofactor :
Dung dịch đệm 0,5M, pH = 6,6, trộn A:B = 1:1.
Dung dịch A: hòa tan 89,535g Na2HPO4. 12H2O với nƣớc thành 500ml.
Dung dịch B: hòa tan 39,0025g NaH2PO4. 2H2O với nƣớc thành 500ml. Ion kim loại MnCl2 0,1M: hòa tan 3,958g MnCl2.4H2O với nƣớc thành 200ml.
Ion kim loại: pha dung dịch stock 0,1M.
MgCl2: hoà tan 1,0165g MgCl2với nƣớc thành 50ml
MnCl2: hoà tan 0,9896g MnCl2với nƣớc thành 50ml
ZnSO4: hoà tan 1,4379g ZnSO4với nƣớc thành 50ml CaCl2: hòa tan 0,5545g CaCl2 với nƣớc thành 50ml
28
FeCl3: hòa tan 1,3517g FeCl3với nƣớc thành 50ml
AlCl3: hịa tan 1,2072gAlCl3với nƣớc thành 50ml
Hóa chất sử dụng đếm số lƣợng ạch cầu :
Dung dịch acid acetic : 5ml.
Xanh methylen : 2÷5 giọt.
Nƣớc cất.
Hóa chất sau khi pha ảo quản trong điều kiện phòng và sử dụng trong tuần. Hóa chất sử dụng định lƣợng Phospho trong phân heo :
HNO3 đậm đặc.
H2O2 đậm đặc.
Dung dịch HCl 9%: hút 125ml dung dịch HCl đậm đặc thêm nƣớc cất 2 lần đủ 500ml.
dung dịch stock Phospho 0,01M – KH2PO4: hòa tan 0,136g KH2PO4 với nƣớc cất
2 lần thành 100ml.
Dung dịch Phospho 500µM: hút 5ml từ dung dịch stock, thêm 95ml nƣớc cất 2 lần.
Thuốc thử:
Dung dịch H2SO4 5,5%: hút 28ml H2SO4 đậm đặc pha với nƣớc cất 2 lần đủ 500ml.
Dung dịch A: 1,5% Amonium molypdate/H2SO4 5,5% (hòa tan 7,5g Amonium molypdate trong dung dịch H2SO4 5,5% đủ 500ml).
Dung dịch B: hòa tan 5g FeSO4 với nƣớc cất 2 lần lạnh thành100ml (pha trong nƣớc đá, dung dịch phải trong suốt, không màu hoặc có màu vàng rất nhạt)
Trộn A:B theo tỉ lệ 4:1 để có đƣợc dung dịch thuốc thử phosphate trong suốt, không màu (dùng trong ngày).
29
2.1.4 Nguyên liệu nghiên cứu
2.1.4.1 Giống heo
Heo đƣợc cung cấp ởi Trang trại ch n ni V nh Khánh, ấp Trung Bình Tiến, xã V nh Trạch, huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang.
Heo đƣợc sử dụng làm thí nghiệm là heo con sau cai sữa (26 ngày tuổi), với số lƣợng là 144 cá thể, trọng lƣợng trung ình là 7±1 kg/cá thể. Giống heo thí nghiệm là giống heo lai hai máu giữa Yourshire và andrace.
2.1.4.2 Thức ăn, nước uống và chuồng trại cho heo
Thức n cho heo đƣợc sản xuất tại Xí nghiệp thức n ch n nuôi thủy sản AFIEX thuộc Công ty Cổ phần Xuất nhập khẩu nông sản thực phẩm An Giang cung cấp. Giai đoạn 2 tuần đầu sau cai sữa, heo đƣợc cho n thức n hỗn hợp dùng cho heo tập n (G300) với hàm lƣợng dinh dƣỡng cao (thành phần trong thức n hỗn hợp G300 gồm: tấm, ắp, ánh đậu nành, ột sữa, ột cá, acid amin, premix vitamin, premix khống, men tiêu hóa, …); giai đoạn 2 tuần sau đó, heo đƣợc cho n thức n hỗn hợp (G301) với hàm lƣợng dinh dƣỡng thấp hơn G300. Thức n đƣợc cho vào hệ thống máng n án tự động tập cho heo con tự n. Thức n đƣợc sản xuất cùng một lô và đƣợc ảo quản trong cùng điều kiện.
30
Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng trong thức n hỗn hợp G300 và G301:
Thành phần dinh dƣỡng Đơn vị tính Thức ăn G300 Thức ăn G301
Độ ẩm (max) % 14 14
ME min Kcal/kg
thức n
3400 3200
Protein thô (min) % 21 20
Xơ thô (max) % 4 4
Canxi (min – max) % 0,8 ÷ 1,2 0,6 ÷ 1,4
P tổng số (min – max) % 0,6 0,5 ÷ 1,2
Lysin tổng số (min) % Khơng có 1,2
Methyonine + Cystin tổng số % Khơng có 0,7
Chlortetracyline mg/kg Khơng có 10 ÷ 15
(Nguồn: Xí nghiệp thức n ch n nuôi thủy sản AFIEX – Công ty Cổ phần Xuất nhập khẩu nông sản thực phẩm An Giang, 2017).
Nƣớc uống cho heo đƣợc khai thác từ nguồn nƣớc giếng khoan, đƣa vào hệ thống ồn chứa, đƣợc diệt khuẩn ằng Chlorine và chuyển đến trực tiếp từng chuồng qua hệ thống ống dẫn và núm uống nƣớc tại chuồng.
Chuồng trại cho heo: Trại nuôi heo con sau cai sữa đƣợc thiết kế theo dạng nửa kín, nửa hở, có ạt nhựa che kín 2 ên; 2 mái lợp ằng tole, có laphong chống nóng. Phía đầu trại có lắp hệ thống làm mát ằng nƣớc và màng lọc, cuối trại có 4 quạt cơng nghiệp lớn để hút khí nhằm làm giảm nghiệt độ trong chuồng. Bên trong trại có 7 dãy chuồng, mỗi dãy có 14 ơ chuồng đƣợc ng n cách nhau ằng hàng rào sắt cao 0,7m, khoảng cách từng song sắt là 6,5cm. Phía dƣới các dãy chuồng là hệ thống thu gom chất thải của heo cho vào ao chứa làm thức n cho cá. Mỗi ơ chuồng có chiều dài 3,6m, chiều rộng 1,6m, cách nền xim ng 0,5m và
31
đƣợc ố trí 1 núm uống nƣớc; 2 ơ chuồng đƣợc ố trí ở giữa 1 máng n án tự động có chiều cao 88 cm, đƣờng kính 38cm. Heo con sau cai sữa đƣợc ni với số lƣợng 9 con / ơ chuồng, trên chuồng có lót pallet nhựa dày 5cm để dễ vệ sinh.
2.1.4.3 Trùn quế
Trùn quế đông lạnh đƣợc cung cấp từ Công ty cổ phần Trùn Quế Củ Chi, (địa chỉ: 1A, đƣờng 29, ấp Tân Định, xã Tân Thông Hội, huyện Củ Chi, TP HCM).
2.1.4.4 Enzyme thương mại Alcalase®
Enzyme thƣơng mại Alcalase® dùng thủy phân protein là SEB-Neutral PL do Công ty TNHH Dịch vụ Đầu tƣ và Xúc tiến Thƣơng mại Hƣng Thịnh Việt Nam cung cấp, hoạt tính enzyme 102000 – 138000 PC/g
2.1.4.5 Enzyme thương mại DigeGrain Delta
Enzyme thƣơng mại DigeGrain Delta dùng để thủy phân phytate do Công ty TNHH Dịch vụ Đầu tƣ và Xúc tiến Thƣơng mại Hƣng Thịnh Việt Nam cung cấp, hoạt tính enzyme 1000000 FTU/g
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Xác định các điều kiện cơ bản của nguyên liệu và phản ứng thủy phân trùn quế có sử dụng enzyme
Tiến hành khảo sát trên các trạng thái của nguyên liệu: nguyên con, xay nhuyễn và phản ứng enzyme có khuấy trộn hoặc khơng khuấy trộn.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện ở 37o
C. Đánh giá hiệu suất thủy phân dựa trên sự còn lại của cơ chất sau mỗi 12 giờ. Mẫu thí nghiệm đƣợc hút 1ml, ly tâm 4oC 14000 rpm trong 10 phút, loại ỏ dịch nổi, phần cặn là lƣợng cơ chất protein còn dƣ và phi protein, tiến hành cân phần cặn này. Hiệu suất thủy phân đƣợc tính theo cơng thức sau:
Hiệu suất thủy phân (%) = [(M0 – Mt)/M0 ] × 100% Trong đó: M0: khối lƣợng chất khô an đầu
Mt: khối lƣợng chất khô cân đƣợc theo thời gian phản ứng Thực hiện phản ứng thủy phân theo ảng sau:
32
Bảng 2.2 Khảo sát các điều kiện cơ ản của nguyên liệu và phản ứng thủy phân trùn quế có sử dụng enzyme
Trùn (g) 20 Dung dịch đệm 0,5M (ml) 4 NaCl (g) 2 Rỉ đƣờng (g) 2 Enzyme (µl) 200 H2O (ml) 11.8
2.2.2 Xác định các điều kiện thủy phân protein trùn quế bằng enzyme thương mại Alcalase® ở quy mơ phịng thí nghiệm
Tiến hành khảo sát trên các điều kiện khác nhau về nồng độ đƣờng ổ sung, nồng độ cơ chất, cofactor, pH.
2.2.2.1 Khảo sát nồng độ đường bổ sung
Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ rỉ đƣờng với các nồng độ: 0%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20% và 40%.
33
Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ rỉ đƣờng ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân trùn quế Nồng độ rỉ đƣờng 0% 1% 2% 5% 10% 20% 40% Trùn (g) 20 20 20 20 20 20 20 Dung dịch đệm 0,5M (ml) 4 4 4 4 4 4 4 NaCl (g) 2 2 2 2 2 2 2 MnCl2 0,1M (ml) 2 2 2 2 2 2 2 Rỉ đƣờng (g) 0 0,4 0,8 2 4 8 16 Enzyme (µl) 200 200 200 200 200 200 200