Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch Phospho 500 µM (ml) 0 1 2 3 4 5
Nƣớc cất 2 lần (ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ Phospho (µM) 0 100 200 300 400 500
Thuốc thử (ml) 5 5 5 5 5 5
ắc đều, để yên ở nhiệt độ phịng, đem đo mật độ quang ở ƣớc sóng 700nm. Dựng đồ thị iểu diễn sự iến thiên của mật độ quang theo nồng độ phospho (µmol/ml). C n cứ vào đƣờng chuẩn có thể xác định hàm lƣợng P trong dung dịch.
Định lƣợng Phospho trong phân heo:
Cân mẫu, ghi nhận số liệu.
Cho mẫu phân vào chén nung, ổ sung 5 giọt HNO3 đặc và 2 giọt H2O. Tiến
hành nung mẫu ở 750ºC, khoảng 2 giờ.
Thu toàn ộ tro cho vào erlen, thêm 40ml HCl 9%, 5 giọt HNO3 -> đun sôi
Hút 20ml dung dịch trên ổ sung thêm nƣớc cất 2 lần đến đủ 100ml.
Hút 5ml mẫu đã chuẩn ị thêm 5ml thuốc thử, lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng, đem đo mật độ quang ở ƣớc sóng 700nm.
Hàm lƣợng Phospho trong mẫu đƣợc tính theo cơng thức:
1 2 1 w v A x w v Trong đó:
A: hàm lƣợng Phospho (µM/g) trong 1 g mẫu (µM/g).
42
W2: khối lƣợng mẫu (g).
V1: thể tích dung dịch thử lấy đi phản ứng màu (20ml). V2: dung tích ình định mức (100ml).
2.2.4.6 Phương pháp thu nhận máu và đếm bạch cầu
Thu nhận máu: Sau 28 ngày nuôi, thực hiện thu 6 mẫu máu/máng n (2 ô chuồng/18 cá thể), máu đƣợc thu nhận để tiến hành xác định số lƣợng ạch cầu.
Tiến hành đếm ạch cầu:
Vệ sinh uồng đếm và ống trộn.
Dùng ống trộn ạch cầu hút máu đến vạch 0,5. Hút tiếp dung dịch trộn ạch cầu đến vạch 10 (máu đƣợc pha loãng 20 lần). ắc đều ống trộn ạch cầu, ỏ 3 giọt đầu, cho một giọt lên uồng đếm hồng cầu và xác định số ạch cầu trong uồng đếm.
Đếm số ạch cầu trong 25 ô lớn (400 ô nhỏ) trên uồng đếm đƣợc giá trị B. Đếm lập lại 3 lần.
Số lƣợng tế bào trong 1mm3
máu: N = B x 200.
2.2.5 Phương pháp xử lý kết quả thực nghiệm
Số liệu thu thập đƣợc tính giá trị trung ình các lần lặp lại, độ lệch chuẩn. Tất cả các số liệu đựơc xử lý trên excel và thống kê theo phần mềm Statgraphics XVIII, so sánh sự khác iệt giữa các nghiệm thức ằng phƣơng pháp ANOVA.
43
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Xác định điều iện cơ ản củ ngu ên liệu và phản ứng thủ ph n tr n qu ằng enz me thƣơng mại Alc l se®
Thí nghiệm xác định điều kiện cơ ản của nguyên liệu và phản ứng thủy phân trùn quế ằng enzyme thƣơng mại Alcalase® đƣợc thực hiện theo mục 2.2.1. Từ kết quả ảng 3.1 chúng tôi nhận thấy thủy phân trùn quế khi thịt trùn đã đƣợc xay nhuyễn và lên men có khuấy đảo cho hiệu suất tốt nhất, lƣợng cơ chất còn 38,579 ± 5.356% sau 24 giờ thủy phân. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng và cộng sự (2014), ê Minh Châu và cộng sự (2015) [34],[44]. Chúng tôi chọn điều kiện này để thực hiện cho các thí nghiệm sau của nghiên cứu.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện cơ ản của nguyên liệu và phản ứng thủy phân trùn quế ằng enzyme thƣơng mại Alcalase®
Giờ Lơ thí nghiệm Cơ chất cịn lại (%) 0 12 24 Trùn nguyên + t nh 100 56,562 ± 3.542 55,264 ± 4.533 Trùn nguyên + khuấy 100 55,486 ± 2.415 53,712 ± 3.224 Trùn xay + t nh 100 50,153 ± 1.650 48,598 ± 2.561 Trùn xay + khuấy 100 46,813 ± 3.405 38,579 ± 5.356
44
Hình 3.1 Đồ thị khảo sát điều kiện cơ ản của nguyên liệu và phản ứng thủy phân trùn quế ằng enzyme thƣơng mại Alcalase®
3.2 Xác định các điều iện thủ ph n protein tr n qu ằng enz me thƣơng mại Alc l se® ở qu mơ phịng thí nghiệm
3.2.1 Khảo sát nồng độ đường bổ sung
Từ kết quả thí nghiệm ở ảng 3.2, thủy phân trùn quế không ổ sung rỉ đƣờng cho kết quả thủy phân đạt hiệu suất cao nhất (cơ chất còn 13,460 ± 4,437) sau 24 giờ. Vì phản ứng đƣợc thực hiện ở điều kiện khơng vơ trùng nên kết quả thủy phân có sƣ tham gia của enzyme và cả vi sinh vật. Tuy nhiên khi vi sinh vật tham gia vào quá trình thủy phân sẽ tạo các sản phẩm phụ có thể gây độc, ảnh hƣởng đến chất lƣợng của dung dịch đạm sau thủy phân. Khi ổ sung 40% rỉ đƣờng, phản ứng thủy phân trùn quế ị ức chế, hiệu suất thủy phân chƣa tới 50% (cơ chất còn 58,860 ± 8,813) . Điều này cho thấy khi ổ sung rỉ đƣờng ở nồng độ cao xảy ra sự ức chế enzyme và vi sinh vật hiện diện trong mẫu. Theo thực nghiệm, chúng tôi chọn ổ sung 10% rỉ đƣờng – thủy phân còn 38,969 ± 16,396% cơ chất, nồng độ đủ để tạo áp suất thẩm
45
thấu ức chế hoạt động của vi sinh vật nhƣng không ảnh hƣởng quá lớn tới hoạt động của enzyme protease.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ rỉ đƣờng ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân trùn quế Giờ Rỉ đƣờng 0 Cơ chất còn lại (%) 12 24 0% 100 21,360 ± 3,547 13,460 ± 4,437 1% 100 32,806 ± 5,295 25,438 ± 7,602 2% 100 35,996 ± 10,059 38,188 ± 7,284 5% 100 47,435 ± 10,258 38,644 ± 9,148 10% 100 45,025 ± 10,279 38,969 ± 8,396 20% 100 54,439 ± 16,846 39,396 ± 12,201 40% 100 67,315 ± 10,818 58,860 ± 8,813
Hình 3.2 Đồ thị khảo sát nồng độ rỉ đƣờng ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân trùn quế
46
3.2.2 Khảo sát nồng độ enzyme
Sau khi lựa chọn đƣợc nồng độ rỉ đƣờng ổ sung vào phản ứng thủy phân trùn quế (10%), chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát nồng độ enzyme ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân trùn quế nhƣ mục 2.2.2.2.
Theo ảng 3.3, khi ổ sung enzyme ở nồng độ 4% cho kết quả thủy phân tốt nhất, lƣợng cơ chất còn lại khoảng 20%. Phân tích ANOVA đa yếu tố với hệ số ý ngh a α = 0,05 cho thấy khơng có sự khác iệt có ý ngh a về hiệu suất thủy phân của các nồng độ ổ sung 1%, 2% và 4% nên chúng tôi chọn ổ sung 1% enzyme so với cơ chất sẽ giúp tiết kiệm chi phí.
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát nồng độ enzyme ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân trùn quế Giờ Nồng độ protease Cơ chất còn lại (%) 0 12 24 0% 100 35,474 ± 9,627 24,072 ± 6,166 0,02% 100 36,084 ± 5,386 25,785 ± 0,732 0,1% 100 31,964 ± 2,521 22,120 ± 1,954 0,2% 100 32,956 ± 2,410 26,024 ± 3,380 0,4% 100 29,117 ± 0,733 24,871 ± 1,366 1% 100 20,367 ± 2,522 20,562 ± 0,731 2% 100 21,215 ± 1,878 20,516 ± 3,594 4% 100 18,951 ± 3,976 16,174 ± 2,875
47
Hình 3.3 Đồ thị khảo sát nồng độ enzyme ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân trùn quế
3.2.3 Khảo sát cofactor
Theo ảng 3.4, khảo sát sự ảnh hƣởng của cofactor ở nồng độ 5mM lên phản ứng thủy phân trùn quế cho thấy khi không ổ sung cofactor cho hiệu quả tốt nhất, hàm lƣợng cơ chất còn 10,812 ± 6,382% sau 24 giờ thủy phân. Phân tích ANOVA với hệ số ý ngh a α = 0,05 cho thấy ổ sung các ion Mg2+
, Mn2+ và Ca2+ ở nồng độ 5 mM cho hiệu suất thủy phân trùn quế tƣơng đƣơng với thí nghiệm khơng ổ sung cofactor. Khi ổ sung Fe2+ và Zn2+ cho thấy sự ức chế hoạt động của enzyme protease, gây giảm hiệu suất phản ứng thủy phân, lƣợng cơ chất còn khoảng 25% sau 24 giờ phản ứng.
48