Cây giống Tỷ lệ tươi/nhân khô Năng suất nhân (kg/ha)
Năm 2017 Năm 2018
Cây nuôi cấy mô 4,5a 1.546a 3.319a
Cây ghép 4,5a 1.545a 3.229a
Cây thực sinh 4,6a 1.358b 3.200a
CV (%) 1,15 3,71 4,48
LSD0,05 ns 124,9 ns
Ghi chú: Các số theo sau bởi các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu hiện sai khác có ý nghĩa ở mức xác suất p <0,05.
Tỷ lệ tươi/nhân (T/N) của lô trồng cây giống nuôi cấy mô đạt tương đương cây cà phê ghép và cây cà phê trồng thực sinh (4,5 và 4,6). Sau 26 tháng trồng (năm 2017), cây nuôi cấy mô sinh trưởng và phát triển tốt tương đương cây thực sinh và cây ghép. Sau 2 năm trồng cây cà phê nuôi cấy mơ cho thu hoạch bói 1.546 kg cà phê nhân tương đương với cây ghép (1.545 kg/ha) và năng suất có
23
tăng hơn so với cây thực sinh (1.358 kg/ha). Năng suất cây nuôi cấy mô và cây ghép cao hơn so với cây thực sinh (188 kg).
Sau 36 tháng trồng (năm 2018), năng suất của cây nuôi cấy mô cao hơn so với cây ghép và cây thực sinh (90 - 119 kg nhân/ha). Mặc dù cao hơn không nhiều, nhưng cũng thể hiện được cây cà phê nuôi cấy mô vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường, tương đương cây cà phê ghép và cây thực sinh. Kết quả này tương tự nhận định của Etienne et al. (2011) cây cà phê ni cấy mơ có biểu hiện các tính trạng nơng học bình thường, có thể sản xuất để thương mại, bởi vì tần suất xuất hiện biến dị phôi sôma không nhiều. Sondahl et al. (1999) trồng so sánh cây cà phê C. arabica cv. Bourbon nuôi cấy mô so với cây thực sinh cùng giống được đánh giá ở Brazil. Các giống cà phê Robusta và Arabica nhân bằng nuôi cấy mô được trồng thử nghiệm ở năm nước sản xuất cà phê Philippines, Thái Lan, Mexico, Nigeria và Brazil. Tất cả các giống được đánh giá ở Philippines cho thấy cây sinh trưởng bình thường, ra hoa và quả bình thường sau hai năm trồng (Sondahl and Baumann, 2001).Tuy nhiên, để có kết luận chính xác khả năng sinh trưởng và cho năng suất cũng như chất lượng của cây cà phê nuôi cấy mô, cần tiếp tục theo dõi.
2.2.1.9 Kết luận
- Đối với cây cà phê giống TR11, áp dụng qui trình sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cần mất thời gian khoảng 22 tháng.
- Cây cà phê nuôi cấy mô sinh trưởng và phát triển bình thường tương đương với với cây ghép và cây thực sinh. Năng suất cây nuôi cấy mô cao hơn cây ghép và cây thực sinh (90 kg - 119 kg/ha).
- Giải pháp ứng dụng bioreactor trong nhân giống cà phê đã được áp dụng ở qui mơ cơng nghiệp, tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao. Đây cũng là cơ sở để có những nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên các cây thân gỗ khác tương tự cây cà phê trên địa bàn Tây Nguyên như: cacao, điều, bơ, macadamia…
2.2.2 Cây mía 2.2.2.1 Giới thiệu 2.2.2.1 Giới thiệu
Mía tím Kim Tân (Saccharum officinarum) có nguồn gốc từ huyện Thạch Thành - Thanh Hóa, là một giống mía đặc sản nổi tiếng ở vùng đất xứ Thanh. Giống mía này có đặc điểm thân màu tím trịn đều, mềm, ngọt. Với những ưu điểm của nó, giống mía tím Kim Tân được trồng ở nhiều địa phương trên cả nước. Hiện tại, phương pháp nhân giống bằng hom là phương pháp nhân giống chủ yếu cho giống mía tím Kim Tân. Bên cạnh đó giống mía tím Kim Tân được
24
canh tác trong thời gian dài với tình trạng khơng kiểm sốt được nguồn giống ban đầu dễ dẫn đến giống bị hỗn tạp, bị nhiễm và lây lan bệnh, cây dễ bị già sinh lý gây thối hóa giống. Vì vậy, để góp phần bảo tồn, phục tráng giống mía tím Kim Tân phục vụ sản xuất hàng hóa, mang lại hiệu quả kinh tế cao, rất cần sử dụng tiến bộ kỹ thuật trong nhân giống in vitro cho cây mía.
Các cơng trình nghiên cứu đã khẳng định sử dụng phương pháp nhân giống mía bằng in vitro mang lại hiệu quả kinh tế và là phương pháp sử dụng khá phổ biến trong sản xuất mía ở quy mơ lớn. Phương pháp này cho phép nhân nhanh, tạo ra một số lượng cây giống lớn trong một thời gian ngắn đặc biệt cây giống có chất lượng tốt, đồng nhất về mặt di truyền, sạch bệnh. Tuy nhiên mỗi giống mía khác nhau có phản ứng với điều kiện mơi trường ni cấy khác nhau (Mulugeta et
al., 2018). Do đó, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho cây mía
tím Kim Tân nhằm góp phần tạo cây giống đồng đều có chất lượng cao cho sản xuất là rất cần thiết.
2.2.2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu a. Vật liệu nghiên cứu a. Vật liệu nghiên cứu
Cây mía tím Kim Tân được lấy tại vườn thí nghiệm thu thập mẫu thuộc xã Thành Trực, huyện Thạch Thành, tỉnh Thanh Hóa.
Mơi trường ni cấy sử dụng là môi trường cơ bản MS.
b. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chọn mẫu mía
Thời điểm lấy mẫu mía là khi cây được 8 tháng tuổi, cây mía có nhiều đặc tính như khơng bị sâu bệnh đổ ngã, ít đốt, lóng mía dài. Mẫu được lấy khi thời tiết khơng mưa, khơ ráo được ít nhất một tuần, chặt lấy phần trên, cách gốc khoảng 10 lóng. Cắt hết tai lá xung quanh, buộc thành bó dựng ngược xuống để nước không đọng trong bẹ lá.
Phương pháp khử trùng mẫu
- Ngoài tủ cấy vơ trùng: Lau tồn bộ mẫu bằng cồn 70o, bóc lá già, lau sạch phấn, cắt phần dài của bẹ mía. Lau mẫu bằng nước cất sạch, sau đó lau lại bằng cồn và cho vào tủ cấy.
- Trong tủ cấy cấy vô trùng: Dùng tay bóc từng lớp bẹ, khi bóc khơng được cho tay qua mẫu, bóc hết lớp bẹ bao bọc bên ngoài. Dùng dao cắt mắt 1 x 1 cm và cắt đỉnh sinh trưởng cấy vào môi trường MS + 2 mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar để khởi động tạo vật liệu ban đầu.
25
Nội dung nghiên cứu
- Giai đoạn lựa chọn chồi vào mẫu: mắt ngủ và đỉnh sinh trưởng tái sinh trên môi trường MS + 2 mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar sau khoảng 2 - 3 tuần; các chồi này sẽ trải qua 3 lần cấy chuyển, sau khoảng 2 - 3 tháng chồi hình thành các cụm chồi nhỏ, các cụm chồi này sẽ được sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho giai đoạn nhân nhanh chồi mía in vitro.
- Giai đoạn nhân nhanh chồi mía: Chồi mía sau giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu tạo cụm chồi, gồm 2 - 3 chồi đơn nhỏ phát triển tốt được sử dụng làm vật liệu cho các thí nghiệm nhân nhanh. Mơi trường thí nghiệm có bổ sung các chất điều tiết BA, Kinetin, BA kết hợp Kinetin và BA kết hợp với IBA ở các nồng độ khác nhau.
- Giai đoạn tạo cây hồn chỉnh: Các chồi mía in vitro cao 6 - 7 cm, lá xanh, phát triển tốt được cấy chuyển trên mơi trường có α-NAA với nồng độ từ 0; 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0 mg/l để kích thích ra rễ.
Tất cả các mơi trường ni cấy in vitro có thành phần cơ bản gồm MS + 30 g/l sucrose + 7,0 g/l agar + 500mg/l THT được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy in
vitro: 16 h sáng/8 h tối, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC. Trước khi bố trí các thí nghiệm thì cấy chuyển mẫu ra môi trường MS + 30 g/l đường + 7 g/l agar ít nhất một tuần để mẫu khơng bị ảnh hưởng bởi các chất điều tiết sinh trưởng.
- Giai đoạn thích ứng cây ngồi tự nhiên: Tiêu chuẩn cây ra ngoài vườn ươm là cây phát triển tốt cao 7 - 10 cm, lá xanh tốt 4 - 5 lá, bộ rễ khỏe mạnh, số rễ trung bình khoảng 10 - 11 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình 1,1 - 1,2 cm.
Huấn luyện cây: Thí nghiệm ra cây in vitro được tiến hành vào tháng 8 - 9 khi nhiệt độ khá cao, nắng nhiều. Trước khi ra cây in vitro, các bình cây in vitro
được mang ra vườn ươm trước 2 - 3 ngày để tập nắng, cho cây quen với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ bên ngoài. Cây con mới ra cây được che bằng lưới đen, ngày tưới 2 lần vào sáng sớm và chiều tối, sau khoảng 1 tuần có thể bỏ lưới che ra.
Chuẩn bị giá thể: Cát lọc sạch rác bẩn, phơi khô, khử trùng; giá thể đất được lấy trực tiếp vườn thí nghiệm trồng mẫu mía tại huyện Thạch Thành, Thanh Hóa; đất được tán nhỏ; giá thể đất: cát được trộn với tỉ lệ 1 : 1.
26
Hình 2.4: Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống mía tím Kim Tân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
(Mai Thị Tân et al., 2019)
2.2.2.3 Kết quả và thảo luận a. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro a. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro
Để tiến hành xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu là tiền đề quan trọng để quyết định sự thành công của nghiên cứu. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ BA cao trong mơi trường ni cấy có hiệu quả tốt đối với việc vào mẫu mía trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mía VN84-4137 bằng cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật của nhóm tác giả Lê Phi Long và Phan Thị Thu Hiền (2013) cũng cho thấy sử dụng môi trường vào mẫu mía từ đỉnh sinh trưởng là MS + 10 g/l agar + 20 g/l đường + 2 mg/l BA. Hơn nữa, từ kết quả thăm dò trên nền một số môi trường tái sinh chồi từ mắt mầm và đỉnh sinh trưởng, môi trường MS + 2 mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar được sử dụng để tạo vật liệu khởi đầu trên hai loại vật liệu là mắt ngủ và đỉnh sinh trưởng của cây mía. Kết quả quan sát được minh họa ở hình 2.5.
27
Hình 2.5: Sự phát triển của chồi mía sau khi vào mẫu
Khi vào mẫu trên hai nguồn vật liệu kết quả cho thấy cả hai vật liệu là mắt ngủ và đỉnh sinh trưởng của cây mía đều phát sinh chồi sau 2 - 3 tuần. Tuy nhiên, các chồi này chưa được tận dụng để làm vật liệu khởi đầu cho quá trình nhân nhanh. Các chồi này trải qua 2- 3 lần cấy chuyển, sau khoảng 2 - 3 tháng các chồi hình thành các cụm chồi nhỏ, các cụm chồi này sẽ được sử dụng làm vật liệu khởi đầu. Mặt khác, vật liệu là đỉnh sinh trưởng khá ít, trong khi đó số lượng mắt mầm mía nhiều. Trên cơ sở đó mắt mầm mía được lựa chọn là nguồn vật liệu thích hợp để tạo vật liệu khởi đầu cho quy trình nhân nhanh.
b. Giai đoạn nhân chồi mía in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro
BA là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng của mô phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào. Trong nhân giống in vitro, BA có vai trò đặc biệt quan
trọng trong việc kích thích sự hình thành chồi non, quyết định hệ số nhân và chất lượng chồi (Hoàng Minh Tấn et al., 2006).
28