3. Nội dung nghiên cứu
3.2.3.1. Tách dòng vùng D-loop
Để tạo điều kiện cho việc xác định trình tự vùng D-loop, chúng tôi tiến hành tách dòng phân tử đoạn này với kích thước 1,3 kb đã nhân được bằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn cặp mồi L16725- H1255. Chúng tôi đã sử dụng vector pJET1/Blunt để tách dòng vùng D-loop. Vector pJET1/Blunt có kích thước khoảng 3,1kb (3128 nucleotide), đây là vector tách dòng thế hệ mới của hãng Fermentas, mới được sử dụng tại các phòng thí nghiệm. Nó có chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với các gen của tế bào chủ E.coli. Trên vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào mang vector này mới có thể sống dược trong môi trường có Amp. Đồng thời, trên vector này còn có chứa gen gây chết Eco47IR, mã hóa cho enzyme nuclease phân hủy DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy, vector được gắn thêm gen ngoại lai sẽ làm lệch khung đọc của gen Eco47IR khiến enzyme được tổng hợp không còn hoạt tính như trước nữa dẫn đến sự không phân hủy được DNA nhân của tế bào chủ. Nhờ có Eco47IR mà quá trình lựa chọn khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Vùng PlacUV5 điều khiển sự biểu hiện của gen Eco47IR một cách đầy đủ mà không cần đến chất cảm ứng IPTG.
Thêm vào đó, vùng MCS (Muntiple Cloning Site) của vector có điểm nhận biết của nhiều enzyme cắt hạn chế như Kpn2I, XhoI, XbaI… nhằm phục vụ cho việc cắt kiểm tra sau khi tách dòng. Ngoài ra, vector mang trình tự 2 mồi PJET1 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc giải trình tự gen.
Như đã biết việc sử dụng Taq polymerase trong PCR sẽ tạo ra khoảng 70% - 90% sản phẩm PCR có thêm một nucleotide A ở đầu 3‟. Mặt khác, pJET1/Blunt lại là vector tách dòng đầu bằng nên chỉ các sản phẩm PCR dầu bằng hoặc đã được bằng hóa mới thực hiện được phản ứng ghép nối với vector này. Do đó, trước khi thực hiện phản ứng ghép nối,chúng tôi làm bằng hóa đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Thành phần của phản ứng làm bằng hóa đầu 3‟
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn như sau: 5µl đệm phản ứng 2X; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã được làm bằng hóa vào 0,5µl vector pJET1 (50ng/µl) bằng 0,5µl enzyme T4 DNA ligase (5u/µl).
Lấy 3µl sản phẩm ghép nối này để biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
dòng DH5α. Các tế bào khả biến được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự đã mang đoạn gen đã nhân được bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.
Tách chiết plasmid
Các tế bào sau khi nuôi cấy được thu nhận bằng ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. DNA tồn tại trong tế bào vi khuẩn E. coli gồm hai dạng: DNA nhiễm sắc thể có dạng mạch thẳng và DNA plasmid dạng mạch vòng. Để thu nhận và tinh sạch DNA plasmid, chúng tôi tiến hành xử lý tế bào thu được sau khi nuôi cấy bằng các dung dịch I, II, III. Dung dịch I (sol I) có tác dụng rửa sạch tế bào và hòa tan tế bào. SDS trong sol II có tác dụng phá màng và cùng với EDTA trong sol I sẽ gắn chặt với Mg2+ làm ức chế hoạt động của các nuclease, nhờ đó DNA được bảo vệ. DNA nhiễm sắc thể có kích thước lớn, liên kết chặt chẽ với protein tạo ra phức hệ nucleoprotein nên cấu trúc của chúng rất cồng kềnh, ngược lại với DNA plasmid có cấu trúc gọn nhẹ. Chính vì thế, khi DNA plasmid đã được giải phóng ra môi trường thì DNA nhiễm sắc thể hầu như vẫn chưa kịp thoát ra ngoài. CH3COOK và CH3COOH trong sol III có tác dụng làm giảm pH của dung dịch về gần với điểm đẳng điện của DNA và gây biến tính protein; cùng với sự có mặt của EtOH 100% ở nhiệt độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thấp, DNA plasmid bị kết tủa và dễ dàng được tách ra nhờ ly tâm. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.7.
Hỗn hợp DNA plasmid thu được sau khi tách chiết thường tồn tại 3 dạng cấu trúc: Dạng siêu xoắn, dạng vòng mở và dạng mạch thẳng. Dạng thứ nhất có cấu trúc không gian gọn nhẹ nhất, được hình thành do liên kết hidro hoặc liên kết tĩnh điện giữa các phần của phân tử plasmid với nhau. Dạng vòng mở có một mạch đơn bị đứt gãy và dạng còn lại có cả hai mạch đều bị đứt gãy. Khi điện di, dạng nào càng có kích thước gọn nhẹ thì sự di chuyển của chúng càng nhanh, càng xa so với vị trí của giếng tra mẫu. Theo đó, dạng siêu xoắn chạy nhanh nhất, tiếp đó là dạng vòng mở và cuối cùng là dạng mạch thẳng.
Hình 3.7. Ảnh điện di một số DNA plasmid trên gel agarose 0,8% ĐC: DNA plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA)
1- 3: DNA plasmid mẫu Ri (Rhy) 4 - 6: DNA plasmid mẫu Mông (Mna)
7- 9: DNA plasmid mẫu Sao (Sdt)
Để tiện lợi cho việc lựa chọn các dòng plasmid được chèn thêm đoạn DNA, khi tiến hành điện di kiểm tra, chúng tôi đã sử dụng một DNA plasmid
đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA). Do vậy, dựa vào độ cao thấp của các băng so với băng đối chứng mà ta có thể dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy: mẫu Rhy, mẫu Mna và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn mẫu Sdt đều có các dòng thứ 2, thứ 4, thứ 7 và thứ 9 (kí hiệu Rhy 2; Mna 4;
Sdt 7; Sdt 9) cao hơn dòng đối chứng. Từ đây, có thể dự đoán các dòng này có thể chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. Để khẳng định được các dòng đã chọn có mang đoạn DNA được nhân lên bằng PCR hay không, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9 bằng enzyme hạn chế.
Kiểm tra plasmid bằng việc xử lý enzyme hạn chế
Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid kể trên bằng phương pháp cắt enzyme hạn chế. Vector pJET1/Blunt có chứa điểm nhận biết của enzyme XhoI ở phía bên trái và chứa điểm nhận biết của enzyme XbaI ở phía bên phải của vị trí ghép nối gen. Mặt khác, trình tự vùng D-Loop đã công bố không chứa điểm nhận biết của 2 enzyme này. Do vậy khi phân tích vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI sẽ thu được các đoạn gen có kích thước gần đúng với kích thước của vector nguyên bản và của đoạn gen đã được ghép nối vào vector. Kết quả phân tích sản phẩm cắt enzyme trên hình 3.8 cho thấy các DNA plasmid tái tổ hợp được cắt thành 2 băng: một băng có kích thước 3,1 kb (tương ứng với kích thước của vector pJET1/Blunt); băng kia có kích thước khoảng 1,3 (tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR). Kết quả này chứng tỏ sản phẩm PCR đã được ghép nối thành công vào vector. Những plasmid tái tổ hợp này được tinh sạch để phục vụ cho việc xác định trình tự gen.
Kết quả của phản ứng cắt trên hình 3.8 cho thấy: trên 3 đường chạy (4, 5 và 6) xuất hiện hai băng: một băng có kích thước 3,1 kb (bằng kích thước của vector pJET1/Blunt), băng khác có kích thước khoảng 1,3 kb (tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR). Đường chạy 2 chỉ có một băng có kích thước 3,1 kb. Như vậy, đã chọn được 3 dòng (1 dòng thuộc mẫu gà Ri (Rhy), 1dòng thuộc mẫu gà Mông (Mna), 1 dòng thuộc mẫu gà Sao (Sdt)) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Những plasmid mang đoạn chèn chứa vùng D-loop này được nhân với số lượng lớn và tinh sạch để phục vụ cho việc giải trình tự nuleotide.
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI M: Thang DNA chuẩn (DNA λ được cắt bằng EcoRI và Hind III) 1. Plasmit không được cắt DNA
2. Sản phẩm cắt của plasmid không có đoạn chèn DNA 3.Sản phẩm PCR
4; 5; 6. Sản phẩm cắt của dòng Ri (Rhy)2; Mông (Mna) 4; Sao (Sdt) 9
3.2.3.2 Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể
Sau khi DNA plasmid được tinh sạch, chúng tôi tiến hành xác định trình tự DNA trên máy đọc trình tự tự động trên cơ sở phương pháp của Sanger Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả trong mục 2.3.2.5.
Xác định trình tự nucleotide từ 2 chiều của tất cả các đoạn DNA có trong các plasmid tái tổ hợp đã được tạo, sử lý bằng phần mềm ABI PRISM®
3100- Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2. Với mỗi chiều đọc ở tất cả các plasmid chúng tôi thu được các đoạn dài khoảng 800 nucleotide. Vì đoạn gen cần xác định trình tự dài khoảng 1,3 kb, trong khi với điều kiện thí nghiệm tốt nhất, máy đọc chỉ xác định được tối đa khoảng 900- 1000 nucleotide. Sử dụng phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Seqscape 2.5 để kết hợp số liệu của 2 chiều đọc chúng tôi thu được trình tự hoàn chỉnh của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vùng D-loop của 2 mẫu nghiên cứu Mna và Rhy với kích thước 1220 bp.
Do điều kiện thời gian có hạn, mẫu gà Sao (Std) trình tự có nhiều C, việc đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-loop của gà Sao chưa đầy đủ. Vì vậy chúng tôi chỉ công bố và so sánh kết quả hai mẫu Mna và Rhy.
So sánh các trình tự Mna và Rhy với nhau và với trình tự D-loop của gà gallus gallus gốc Nhật Bản (Mã số AB268515) được công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL (EBI)/GenBank/DDBJ [37], chúng tôi thu được kết quả hình 3.9.
10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 acctaactcccctactaagtgtaccccccctttcccccccagggggggtatactatgcat
Mna .........-.............
Rhy .........-.............
70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 aatcgtgcatacatttatataccacatatattatggtaccggtaatatatactatatatg
Mna ......................
Rhy ......................
130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 tactaaacccattatatgtatacgggcattaatctatattccacatttctcccaatgtcc
Mna .................
Rhy ................. 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 attctatgcatgatccaggacacactcattcaccctccccatagacagctccaaaccact
Mna ...........A....T........T..T...
Rhy ...........A....T........T..T... 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 accaagtcacctaactatgaatggttacaggacataaatctcactctcatgttcttcccc
Mna .T....C......................C....
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 caacaagtcacctaattatgaatggttacaggacatacatttaactaccatgttctaacc
Mna T.......C.....................
Rhy T.......C..................... 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 catttggttatgctcgccgtatcagatggatttattgatcgtccacctcacgagagatca
Mna .............................................
Rhy ............................................. 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 gcaacccctgcttgtaatgtacttcatgaccagtctcaggcccattctttccccctacac
Mna ......C........................
Rhy ......C........................ 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 ccctcgccctactt-gccttccaccgtacctctggttcctcggtcaggcacatcccatgc
Mna .......-.........................
Rhy .......-.........................
550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 ataactcctgaactttctcactttt-cacgaagtcatctgtggattatcttcccctcttt
Mna .......-.................
Rhy .......-................. 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 agtccgtgatcgcggcatcttctctcttctattgctgttggttccttctctttttggggc
Mna ..................................
Rhy ..................................
670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 ttcttcacaggttgcccttcacagtgcgggtgcggagtgctattcaagtgaagcctggac
Mna ...........................................
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 tacacctgcgttgcgtcctatcctagtcctctcgtgtccctcgatgagacggtttgcgtg
Mna .........................................A
Rhy .......................................... 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 tatggggaatcatcttgacactgatgcactttggatcgcatttggttatggttcttccac
Mna .........................................
Rhy ......................................... 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 cccccccggtaaatggtgctatttagtgaatgcttgtcggacatatttttatcaattttc
Mna .................................
Rhy ................................. 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 acttcctctattttcttcacaaaactaggaaattcaccacaattttttctttgttatttt
Mna ............ Rhy ............ 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ttaattttttttttattttttaaaaacattttttaaaaaactaaattacatacaaactac Mna ... Rhy ... 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 cgcataaaatccctcaaactatacaaacgtttatcgtataatatatatacattattgttt
Mna .................
Rhy .................
1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 attctatcattattagagaaactccactaccaaaaccatcattaaaacaaaaatttacat
Mna .........
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AB268515 gccacttaactcccctcacaaacaatcgttatttatattgttaattagcaaacacaaaac
Mna ................ Rhy ...........--....... 1210 1220 ....|....|....|....| AB268515 ctgccttctaccactataaa Mna .CA... Rhy ......
Hình 3.9. So sánh trình tự D-loop của hai mẫu nghiên cứu Ri (Rhy) và Mông (Mna) với trình tự tham khảo mã số AB268515
So sánh trình tự 2 mẫu Mông Nghệ An (ký hiệu Mna) và Ri Hưng Yên (Rhy) với trình tự chuẩn chúng tôi thấy có 16 điểm đa hình/đột biến (khác biệt nucleotide). Mẫu gà Mna có 14 điểm (chiếm 1,15%) và mẫu gà Rhy có 13 điểm khác biệt với trình tự chuẩn (chiếm 1,1%). Trong 16 điểm khác biệt này cả mẫu gà Mna và Rhy đều mất một nucleotide C ở vị trí số 30 so với trình tự chuẩn. Cả hai dòng thuộc mẫu gà Mông nghệ An và Ri Hưng Yên đều cùng có sự khác biệt nucleotide so với trình tự chuẩn AB268515 đó là các đột biến: Thay thế C bằng T (C T) ở các vị trí 203, 229, 232, 242, 301; Thay thế T bằng C (T C) ở các vị trí 246, 296, 316, 432; Thay thế G thành A (G
A) ở vị trí 198.
Ngoài ra giữa hai dòng thuộc mẫu gà Mông nghệ An và Ri Hưng Yên còn có sự khác biệt với nhau ở 5 điểm đa hình (chiếm 0,4%) ở các vị trí:
Mẫu Mna đột biến thay G A ở vị trí 778; Mẫu Rhy đột biến mất 2 nucleotide A ở vị trí 1181, 1182; Mẫu Mna vị trí 1201 đột biến thay T C
và vị trí 1202 đột biến thay G A. Các sai khác giữa các mẫu chủ yếu là đột biến kiểu đồng hoán (81,25%), được thống kê ở bảng 3.5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.5. Thống kê các điểm đa hình ở 2 mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn
Chúng tôi đã so sánh trình tự vùng D-loop của 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự của các chủng gà đã được công bố WhiteLergo gốc Anh lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số AB114078 [37], Lương Phượng, Ác Tiềm gốc Trung Quốc [3] để so sánh mức sai khác về trình tự nucleotide và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng kết quả so sánh bảng 3.6.
SST Mẫu Thay đổi
nucleotide Vị trí trên ty thể Kiểu biến dị
1 Mna, Rhy del C 30 Mất 1 nucleotide
2 Mna, Rhy G A 198 Đồng hoán
3 Mna, Rhy C T 203 Đồng hoán
4 Mna, Rhy C T 229 Đồng hoán
5 Mna, Rhy C T 232 Đồng hoán
6 Mna, Rhy C T 242 Đồng hoán
7 Mna, Rhy T C 246 Đồng hoán
8 Mna, Rhy T C 296 Đồng hoán
9 Mna, Rhy C T 301 Đồng hoán
10 Mna, Rhy T C 316 Đồng hoán
11 Mna, Rhy T C 432 Đồng hoán
12 Mna G A 778 Đồng hoán
13 Rhy del A 1181 Mất 1 nucleotide
14 Rhy del A 1182 Mất 1 nucleotide
15 Mna C T 1201 Đồng hoán
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.6. So sánh tỷ lệ sai khác trình tự nucleotide của một số giống gà
Hệ số giống nhau
AB268515 Mna Rhy Legho Ati LPh AB268515 0.0000 0.9892 0.9917 0.9892 0.9876 0.9967 Mna 0.0108 0.0000 0.9975 0.9892 0.9917 0.9892 Rhy 0.0083 0.0025 0.0000 0.9926 0.9926 0.9901 Legho 0.0108 0.0083 0.0074 0.0000 0.9934 0.9892 Ati 0.0124 0.0083 0.0074 0.0066 0.0000 0.9876 LPh 0.0033 0.0108 0.0099 0.0108 0.0124 0.0000 Hệ số khác nhau
Qua bảng 3.6 và so sánh sai khác trên trình tự gen cho thấy sự sai khác trình tự nucleotide giữa gà Mông với gà Lương Phượng [3] là cao nhất 1,08% (13 điểm đa hình), gà Ri với gà Lương Phượng là 12 điểm đa hình chiếm 0,99% và sai khác về trình tự nucleotide giữa gà Mông với gà Ri là thấp nhất 0,25%