3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA
Nguyên tắc chung
Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [3]: tạo ra các đoạn oliogonuleotide hơn kém nhau 1 nuleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, DNA plasmid 200ng BigDye và nước với tổng thể tích 15 l.
Chu trình nhiệt
Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 như sau: 94ºC- 1 phút; (96ºC-10 giây; 50ºC- 5 giây; 60ºC- 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4ºC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ 3.1.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tƣơi
Đây là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng trứng, trứng nhiều lòng đỏ được nhiều người ưa thích bởi lòng đỏ là nơi tập trung nhiều chất dinh dưỡng, nhiều loại protein, lipit, các vitamin, axit béo no và không no bổ dưỡng, dễ tiêu... Vì vậy, chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến chỉ tiêu này, kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1. và hình 3.1.
Bảng 3.1.Tỷlệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tươi (n=30) Trứng gà Tỷ lệ lòng đỏ (%) X X m Tỷ lệ lòng trắng (%) X mX Tỷ lệ lòng đỏ/ lòng trắng Vỏ( %) X X m Ri (Rhy) 32.7 ± 0,66 57.9± 0,81 0.56 9.4± 0,22 Mông (Mna) 34.82 ± 0,53 54.05± 0,77 0.65 11.13± 0,13 Sao (Sdt) 29.67± 0,84 54.5± 0,58 0.55 15.9± 0,26 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ lòng đỏ (%) Tỷ lệ lòng trắng (%) Vỏ (%) chỉ tiêu so sánh %
Ri (Rhy ) Mông (Mna) Sao (Sdt)
Hình 3.1.Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà thí nghiệm
Theo kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 tỷ lệ lòng đỏ ở gà Mông cao nhất, thấp nhất ở gà Ri, tỷ lệ lòng trắng gà Ri cao nhất, tỷ lệ vỏ cao nhất ở gà Sao. Tỷ lệ này khá đồng đều ở các nhóm trứng nghiên cứu, đây đều là những giống gà
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn có chất lượng trứng cao được ưa chuộng trên thị trường.
3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô
Tỉ lệ giữa hàm lượng nước và vật chất khô trong trứng gà là một chỉ tiêu quan trọng, rất có ý nghĩa trong việc đánh giá chất lượng của trứng gà. Sau khi tiến hành cân, sấy mẫu trứng gà ở 600C trong 3 ngày cho đến khi khối lượng không thay đổi, kết quả được trình bày trong bảng 3.2. và hình 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng vật chất khô trong trứng gà (n = 30)
Trứng gà Lòng đỏ X X m Lòng trắng X X m Vỏ X X m Cả quả X X m Ri (Rhy) 47,28± 0,96 13,52± 0,41 9,022± 0,09 50,34± 1,1 Mông (Mna) 50,76± 1,03 14,64± 0,39 9,105± 0,11 52,15± 1,4 Sao (Sdt) 54,09± 1,17 15,98± 0,53 9,519± 0,25 55,09± 1,3 0 10 20 30 40 50 60 lòng đỏ Lòng trắng Vỏ Cả quả Chỉ tiêu so sánh %
Ri (Rhy) Mông ( Mna) Sao (Sdt)
Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng vật chất khô trứng gà thí nghiệm
Hàm lượng nước lòng đỏ, lòng trắng, vỏ và cả quả đều cao nhất ở trứng gà Ri (Rhy): 52,72% ; 86,48% ; 9,78; 49,66 và thấp nhất ở gà Sao (Sdt): 45,91%; 84,02%; 4,81%; 44,91%. Tỷ lệ vật chất khô ở trứng gà Sao là cao nhất và ở trứng gà Ri là thấp nhất. Tỷ lệ nước lòng đỏ và lòng trắng theo nghiên cứu của Lê Viết Ly (2001) [5] ở gà Ri là 47,32%; ± 1,137; 87,925 ± 0,109 và vật chất khô lòng đỏ là 52,616 ± 1,137 và lòng trắng là 12,075 ± 0,109. Còn gà Mông
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ở Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng là 12,41. Ở trứng gà Ác hàm lượng nước lòng đỏ là 49,3% ± 1,9; hàm lượng nước lòng trắng là 88,8% ± 0,4 [9]; Hàm lượng nước ở lòng đỏ trứng nói chung khoảng 49% , hàm lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50% tùy thuộc vào thời gian và điều kiện bảo quản. Như vậy kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước, hàm lượng nước và vật chất khô là tính trạng số lượng, nó phụ thuộc vào giống, nguồn thức ăn và đặc biệt còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản trứng như phần tổng quan đã đề cập.
3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số
Hàm lượng lipid tổng số cũng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng trứng. Lipid là một trong những chất dự trữ đem lại giá trị năng lượng cao rất cần thiết cho cơ thể sinh vật nói chung và gà nói riêng. Hàm lượng lipit tập trung chủ yếu ở lòng đỏ, lòng trắng hàm lượng lipit không đáng kể. Do đó hàm lượng lipit liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ lòng đỏ/lòng trắng.
Kết quả đo chỉ tiêu hàm lượng lipid tổng số chiết bằng petroleum ether được trình bày ở bảng 3.3. và hình 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm (n = 10)
Trứng gà L.L đỏ (%) X X m L.Ltrắng (%) X X m L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) X X m Ri (Rhy) 64± 0,9 11.33± 0,3 5.65 37.67± 0,58 Mông (Mna) 63.33± 0,3 5.33± 0,8 11.88 34.33± 0,3 Sao (Sdt) 64.67± 0,8 6.67± 1.19 9.70 35.67± 0,65
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 0 10 20 30 40 50 60 70 L.Lòng đỏ (%) L.Lòng trắng (%) L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh %
Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt)
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm
Qua bảng 3.3. và hình 3.3. ta thấy hàm lượng lipid lòng đỏ cao nhất ở gà Sao (Sdt) và thấp nhất ở gà Mông (Mna). Theo tác giả Rôse [27] thì hai phần ba lipit trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron. Hàm lượng mỡ trong trứng ở dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng acid béo không no rất cao, hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt và phospho.Vì vậy lòng đỏ trứng được nhiều người ưa chuộng, hàm lượng mỡ trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi theo khẩu phần ăn.
Lipit lòng trắng cao nhất ở gà Ri và thấp nhất ở gà Mông. Như vậy, ta thấy rằng hàm lượng lipid tổng số cao nhất ở trứng gà Ri (37.76%) thấp nhất ở trứng gà Mông Nghệ An (34.33%). Nếu so sánh với kết quả nghiên cứu trên trứng gà công nghiệp của Rôse [27] thì hàm lượng lipit của các giống gà trên cao hơn hẳn. Tỷ lệ lipit lòng đỏ/lòng trắng cao nhất ở gà Mông, thấp nhất ở gà Ri.
3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số
Hàm lượng protein là một chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá giá trị dinh dưỡng của trứng gà. Bằng phương pháp Lowry với máy đo quang phổ, chúng tôi đã thu được kết quả hàm lượng protein thô ở trứng gà của các giống nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. và hình 3.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.4. Hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm (n = 10)
Trứng gà Pr-Lđỏ (%) X X m Pr-Ltrắng(%) X X m Pr-Lđỏ/ Pr-Ltrắng Pr tổng số %) X X m Ri (Rhy) 18.32± 0,64 12.86± 0,24 1.42 15.59± 0,42 Mông (Mna) 16.31± 0,51 12.94± 0,33 1.26 14.63± 0,39 Sao (Sdt) 20.27± 0,82 14.2± 0,49 1.43 17.24± 0,51 0 5 10 15 20 25 Pr-Lđỏ Pr-Ltrắng (%) Pr-Lđỏ/ Pr- Ltrắng Pr tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh %
Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt)
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm
Qua bảng 3.4. và hình 3.4. ta thấy hàm lượng protein tổng số cao nhất ở trứng gà Sao (17,24%) và thấp nhất ở trứng gà Mông (14,63%). Đặc biệt hàm lượng protein lòng đỏ rất cao 20,27%. Gà sao là giống gà đẻ trứng tập trung 6 tháng liền từ tháng 3 đến tháng 9 (âm) sau đó người ta thu hoạch thịt gà trưởng thành và nuôi lứa khác nên điều này rất có ý nghĩa kinh tế. Kết quả nghiên cứu trên có thể đưa ra một định hướng về chăn nuôi gà Sao, một giống gà rất có giá trị kinh tế, dễ nuôi.
Theo kết quả nghiên cứu trên lòng đỏ của trứng gà Ác [9] có hàm lượng protein là 17,6% ± 0,5 thì hàm lượng protein lòng đỏ của trứng gà ri cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác [33]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu trên gà Mông nuôi tại Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ protein lòng đỏ là 16.66%, lòng trắng 11,01%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ
Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Sao chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, tách dòng nhằm xác định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này để tìm ra sự khác biệt giữa chúng.
3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà
Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu nhận và tinh sạch một lượng axit nucleic đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các thí nghiệm tiếp theo. Một trong những mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzym phân giải thoát ra môi trường khi các màng tế bào bị phá vỡ). Để đạt được hiệu suất và độ tinh sạch cao nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu, cho nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russell để tách chiết DNA [28].
Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39ºC trong 1 giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng. Sau khi rã đông, đem ly tâm dung dịch máu đã được hòa tan trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu. Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nuclease bị ức chế. Như vậy, cả SDS và EDTA đều tham gia bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. Hơn thế, pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của nó; đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với protein histon.
Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn hợp Chloroform:Isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần.
Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 l CH3COONa 3M, pH5,2 và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nuleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện - 20ºC trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng EtOH 70%, làm khô và hòa tan tủa trong nước. Trong dung dịch lúc này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại RNA bằng RNAse, ủ ở 37ºC trong 2-3 giờ. Hòa tan DNA tinh sạch trong nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết quả được thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5.Ảnh kết quả điện di DNA tổng số M: Marker DNA lamda; 1. DNA tổng số của gà Ri; 2. DNA tổng số của gà Mông; 3. DNA tổng số của gà Sao
Kết quả điện di cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Mông, Sao đều sáng tập trung và tương đối rõ nét, không có những “mảnh vụn” tạo nên vệt sáng kéo dài phía dưới. Hai băng DNA thu được có kích thước tương đương với vạch 21kb của marker DNA lamda Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể
D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xương sống. Vùng này có chứa các điểm khởi đầu sao chép và các promoter phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trưng tích lũy các đột biến cao gấp 5-10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA trong nhân, D-loop trở thành vùng ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Vì thế, để đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Mông, Sao, chúng tôi chọn trình tự nuleotide của vùng D-loop như một công cụ để nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 [3] để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số đã thu được. Các thông tin về cặp mồi này như sau:
L16725 (Tm = 60ºC): 5‟-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3‟(19 nuleotide) H1255 (Tm = 55ºC): 5‟-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3‟(21 nuleotide)
Cặp mồi H1255 - L16725 được lựa chọn bởi vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ Gà (Galliformes) [3]. Khi sử dụng cặp mồi này, chúng tôi dự tính sẽ nhân được đoạn điều khiển có kích thước 1227 bp.
PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng như thành phần và nồng độ các chất tham gia.
Chu trình nhiệt của PCR
Điều quan trọng nhất là sự lựa chọn và tìm ra nhiệt độ gắn mồi thích hợp. Nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn Tm của các cặp mồi được sử dụng từ 3 - 5ºC để cho mồi có thể bắt cặp tốt với DNA khuôn. Tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 30, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính như sau:
- Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thường khoảng 94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ được hoạt tính. Thời gian biến tính tuỳ thuộc vào hàm lượng G - C và chiều dài của phân