3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen
Kĩ thuật tách dòng gen bao gồm 4 bước sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phản ứng nối ghép được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của bộ hóa chất Gene JETTM
PCR Cloning Kit. Vector tách dòng trong bộ Kit này là pJET1/Blunt chỉ ghép nối được với những đoạn DNA có đầu bằng hoặc đã dược làm bằng hóa. Ngoài ra hãng sản xuất đã cung cấp kèm theo enzyme AND blunting có tác dụng làm bằng hóa đầu của đoạn DNA cần ghép nối. Vì vậy, bộ Kit này phù hợp cho việc tách dòng không chỉ những đoạn gen đầu bằng mà cả những đoạn gen đầu dính (sản phẩm cắt enzyme giới hạn, sản phẩm PCR).
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt
Các sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme taq polymerase trước khi tiến hành phản ứng ghép nối gen cần làm bằng hóa đầu 3‟ trong một hỗn hợp phản ứng gồm có 5µl 2X Reaction Buffer; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Phản ứng ghép nối gen được tiến hành bằng cách bổ sung vào 0,5µl vector pJET1/Blunt Cloning vector (50ng/µl) và 0,5µl enzyme nối T4 ligase (5u/µl). Hỗn hợp này được để ở nhiệt độ phòng từ 5-30‟ sau đó dùng để biến nạp vào tế bào E. Coli.
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
Bổ sung 2 l sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -80oC, giữ trong đá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 phút. Sốc nhiệt ở 42ºC trong 90 giây sau đó chuyển ngay vào đá và giữ trong 5 phút. Bổ sung 300 l SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37ºC trong 1 giờ. Cấy trải các tế bào này trên môi trường LB đặc có bổ sung thêm các thành phần như sau: Amp (50 l/ml) và nuôi ở 37ºC qua đêm.
*Thành phần các môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
- LB lỏng (môi trường Luria- Bertani): Bacto-Trypton 10g/l; cao nấm men 5g/l; NaCl 10g/l; NaOH 2mM.
- LB đặc: gồm môi trường LB lỏng có bổ sung Agar - Agar 15g/l.
- Môi trường SOC: Trypton 5 %; cao nấm men 0,5 %; NaCl 10mM; KCl 2,5mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM; Glucose 20mM.
Tách DNA plasmid
Các khuẩn lạc trắng sau khi biến nạp được cấy chuyển, nuôi lắc với tốc độ 200 v/p trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 37ºC, 15 giờ. Sau đó, lắc đều hỗn hợp nuôi cấy và đổ dịch vào trong ống eppendoft loại 1,5 ml rồi tiến hành thu plasmid theo quy trình kỹ thuật sau:
Ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. Bỏ dịch, thấm khô. Bổ sung 150 l sol I, vortex cho tan tủa.
Thêm 150 l sol II, đảo nhẹ, và giữ trong đá.
Thêm 150 l sol III, đảo nhẹ, giữ trong đá hoặc để trong tủ lạnh 0ºC trong 5'. Ly tâm 12000 vòng, 15 phút, 4ºC. Hút dịch sang ống eppendoft mới.
Thêm 1 ml cồn 100%, đảo nhẹ và để lạnh ở -20ºC trong ít nhất là 3 giờ. Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Thu cặn, rửa tủa bằng EtOH 70%, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, 4ºC. Làm khô mẫu trong máy hút chân không. Cho 30 l RNAse 10 g/ ml, búng đều và ủ mẫu ở bể ổn nhiệt ở 37ºC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
*Thành phần của các dung dịch tách chiết plasmid:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Dung dịch II (Sol II): SDS 10 %, NaOH 0,2M. Pha mới trước khi sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Dung dịch III (Sol III): CH3COOK, CH3COOH (giữ ở tủ 4ºC). Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
Mục đích của bước này là kiểm tra xem đoạn DNA đích có được chèn vào vector hay không.
Thành phần của phản ứng cắt bao gồm: Buffer Tango 1 l; enzyme
XbaI 0,2 l (10u/ l); DNA plasmid 3 l; H2O 5,6 l (tổng thể tích 10 l). Hỗn hợp này sau đó đem ủ ở 37ºC trong ít nhất 3 giờ. Sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%.