3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật
Nguyên tắc chung
Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.
Quy trình kỹ thuật
Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Sambrook và Russell [28] các bước như sau:
Bước 1: Hoà tan 500 l máu với 500 l PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4ºC, đổ dịch, thu cặn.
Bước 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 m proteinase K. Mẫu được ủ ở 65ºC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 l dịch.
Bước 3: Bổ sung một lượng tương đương Phenol:Chlorofom:Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Hút pha trên vào ống mới.
Bước 4: Thêm một thể tích tương đương Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15phút, 4ºC. Thu pha trên.
Bước 5: Thêm CH3COONa một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20º trong 15h (qua đêm).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 6: Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung 500 l cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC, bỏ dịch và thu cặn.
Bước 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hoà tan cặn trong 50 l H2O, búng nhẹ.