3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm: phịng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ ngày 03 tháng 01 năm 2011 đến ngày 24 tháng 04 năm 2011.
3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
3.1.2.1 Nguyên liệu, hóa chất
♦ Bưởi năm roi
♦ Nấm mốc Aspergillus niger ♦ Pectin, maltodextrin ♦ Cồn ♦ Naringin chuẩn ♦ Đệm acetate ♦ NaNO3 ♦ KH2PO4 ♦ KCl ♦ MgSO4.7H2O ♦ FeCl3 ♦ Pepton
♦ Đường saccharose, D-glucose ♦ Na2CO3 ♦ NaOH ♦ Diethylenglycol 3.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ ♦ Tủ ủ, tủ cấy, tủ lạnh ♦ Máy lắc
♦ Máy ly tâm lạnh (Rotana 46 R, Germany) ♦ Waterbath
♦ pH kế (TOA pH meter HM – 12P) ♦ Thiết bị thanh trùng
♦ Máy siêu âm
♦ Máy đo quang phổ Spectrophotometer (U-2800, Hitachi, Nhật Bản)
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu
Sử dụng nấm mốc Aspergillus niger (giống được Trịnh Thị Anh Tâm phân lập và tuyển chọn từ vườn bưởi Năm Roi xã Mỹ Hịa, huyện Bình Minh, Vĩnh Long) cấy vào mơi trường thạch nghiêng (PDA) đã tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Ủ ở 300C trong 3-5 ngày.
Lấy phần vỏ lụa của bưởi năm roi cắt nhỏ, sấy khô (700C, 8 giờ). Sau đó cân 2,5g vỏ lụa sấy khơ, cho vào 500ml nước cất, trích ly chất tan trong 1 giờ ở 1000C (5g/l). Dịch trích vỏ lụa sau khi lọc được bổ sung thêm các thành phần như khống, đường, pepton... Điều chỉnh pH mơi trường về 4,5. Hỗn hợp được đồng nhất bằng máy siêu âm, sau đó cho vào bình tam giác 250 ml (50 ml/bình). Tiếp đến thanh trùng ở 1210C (15 phút), để nguội và chủng nấm mốc Aspergillus niger với mật số khoảng 107, tiến hành lắc mẫu trong thời gian 3 ngày, vận tốc lắc 150 vòng/phút (Nguyễn Kim Thiên, 2010).
Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme naringinase được trình bày trong bảng sau.
Bảng 2: Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme naringinase
Thành phần Nồng độ (g/l) NaNO3 2,0 KH2PO4 1,0 KCl 0,5 Na2CO3 0,1 MgSO4.7H2O 0,5 FeCl3 0,15 Pepton 5,0 D-glucose 5,0 Enzyme bromalain 0,1
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 lần lập lại. Kết quả được tính tốn thống kê và vẽ biểu đồ bằng chương trình Stagraphics 4.0, excel.
3.2.3 Phương pháp phân tích mẫu
Xác định hoạt tính enzyme naringinase dựa vào lượng naringin bị thủy phân bằng phương pháp Davis (1947).
Xác định hàm lượng naringin bằng phương pháp Davis (1947). Hàm lượng naringin được đo ở bước sóng 420 nm. Dựa vào Abs đo được và đường chuẩn để xác định hàm lượng naringin. Từ đó xác định được hoạt tính enzyme naringinase.
3.3 NỘI DUNG VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả của việc bổ sung pectin, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme
naringinase.
Mục đích: Xác định nồng độ pectin và nhiệt độ bảo quản sao cho hoạt tính enzyme naringinase ổn định nhất.
Chuẩn bị mẫu:
Sinh tổng hợp enzyme naringinase như đã nêu ở trên. Hồ hóa pectin trước khi bổ sung vào dung dịch enzyme thơ.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nhân tố và lặp lại 2 lần. Nhân tố A: nồng độ pectin bổ sung (% w/v)
A1: 0% A2: 0,1% A3: 0,3% A4: 0,5%
Nhân tố B: nhiệt độ bảo quản B1: 40C
B2: -160C
Nhân tố C: thời gian bảo quản C1: 0 ngày
C2: 1 ngày C3: 2 ngày
C4: 3 ngày C5: 4 ngày
Số nghiệm thức: 4 x 2 x 5 = 40 Tổng số mẫu thí nghiệm: 40 x 2 = 80
Chỉ tiêu theo dõi: Xác định hoạt tính enzyme naringinase, kiểm soát pH và theo dõi các biến đổi vật lý.
Ghi nhận kết quả: Xác định hoạt tính naringinase ngay thời điểm đem bảo quản và sau mỗi 24h.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin, nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme naringinase. và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme naringinase.
Mục đích:
Xác định nồng độ maltodextrin bổ sung và nhiệt độ bảo quản sao cho hoạt tính enzyme naringinase ổn định nhất.
Chuẩn bị mẫu: Maltodextrin được hồ hóa trước khi cho vào enzyme thô để bảo quản.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nhân tố và lặp lại 2 lần. Nhân tố D: nồng độ maltodextrin bổ sung (% w/v)
D1: 0% D2: 10% D3: 20% D4: 30%
Nhân tố E: nhiệt độ bảo quản E1: 40C
E2: -160C
Nhân tố F: thời gian bảo quản F1: 0 ngày
F2: 1 ngày F3: 2 ngày F4: 3 ngày F5: 4 ngày
Số nghiệm thức: 4 x 2 x 5 = 40 Tổng số mẫu thí nghiệm: 40 x 2 = 80
Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định hoạt tính enzyme naringinase, tìm ra nồng độ maltodextrin tối ưu cho qua trình bảo quản. Đồng thời theo dõi các biến đổi vật lý, và sự thay đổi của độ nhớt.
Ghi nhận kết quả:
Xác định hoạt tính naringinase ngay thời điểm đem bảo quản và sau mỗi 24h. Đo độ nhớt dung dịch sau mỗi 24h.
3.3.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu hiệu quả của việc kết tủa protein bằng ethanol (cồn).
Mục đích: Xác định nồng độ C2H5OH thích hợp để thu được kết tủa có độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi cao nhất.
Chuẩn bị mẫu:
Sinh tổng hợp enzyme naringinase như đã nêu.
Cồn và dung dịch enzyme được làm lạnh riêng ở nhiệt độ -160C trước khi tiến hành tủa.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 2 lần lặp lại.
Nhân tố G: nồng độ cồn (v/v) bổ sung với tỉ lệ cồn:enzyme là 1:3 G1: 00 G2: 700 G3: 850 G4: 950 Số nghiệm thức: 4 Tổng số thí nghiệm: 4 x 2 = 8 Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định nồng độ C2H5OH tối ưu được sử dụng cho quá trình kết tủa. Hiệu suất thu hồi enzyme (%) ứng với từng nồng độ cồn khác nhau.
Ghi nhận kết quả: